| Summary: | Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias As micobacterioses causam sérias preocupações na produção animal e na vida selvagem, em todo o mundo. As infeções micobacterianas têm sido descritas em centenas de espécies de animais selvagens podendo afetar todos os animais vertebrados. Como estas infeções são de carácter crónico, a melhor estratégia de controlo passa pela identificação precoce dos animais infetados, melhorando a metodologia de diagnóstico e tornando efetivos os programas de controlo. Com o desenvolvimento das técnicas de biologia molecular aplicadas à microbiologia, o conhecimento da ecologia das micobactérias avançou rapidamente em todas as áreas. Na medicina humana a reação em cadeia de polimerase (PCR) é aceite como técnica de diagnóstico, substituindo ou complementando o isolamento bacteriano e o método de Ziehl-Neelsen. As espécies do género Mycobacterium responsáveis pela tuberculose nos humanos e outros animais são incluídas no complexo Mycobacterium tuberculosis. As espécies do complexo Mycobacterium avium causam uma variedade de patologias, incluindo lesões típicas de tuberculose em humanos e aves, infeções disseminadas em pacientes imunodeprimidos, linfadenites em humanos e outros mamíferos e paratuberculose em ruminantes. O objetivo do presente trabalho é compreender melhor o papel dos mamíferos selvagens na epidemiologia das micobacterioses zoonóticas e não zoonóticas na vida selvagem, em Portugal. A presente tese está estruturada em cinco capítulos. O capítulo I consiste na revisão geral sobre a classificação e biologia, epidemiologia, sinais clínicos, patologia, técnicas de diagnóstico, e preocupações de saúde pública das micobactérias dos complexos Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium avium, em mamíferos selvagens. O capítulo II é dedicado ao complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC). Este capítulo está dividido em três estudos: O Capítulo II.1 descreve um estudo alargado sobre a presença de Mycobacterium bovis na população selvagem em Portugal. Neste trabalho foi estudada uma população de 2116 mamíferos selvagens e a prevalência encontrada por espécie foi: 26.9% na raposa vermelha (Vulpes vulpes), 20.0% no Saca-rabos (Herpestes ichneumon), 21.4% no javali (Sus scrofa) e 38.3% no veado europeu (Cervus elaphus). Os resultados deste estudo confirmam a presença de Mycobacterium bovis em carnívoros selvagens, em Portugal. No capítulo II.2 foi confirmada a infeção disseminada por Mycobacterium bovis em raposas vermelhas em Portugal, demonstrando-se pela primeira vez a ocorrência de infeção natural no cérebro destes animais. No capítulo II.3 foi demonstrado, pela primeira vez, a infeção por Mycobacterium bovis em saca-rabos. O capítulo III é dedicado ao complexo Mycobacterium avium (MAC). Este capítulo está dividido em sete estudos: No capítulo III.1 pesquisou-se a presença de anticorpos contra as espécies do complexo Mycobacterium avium em mamíferos selvagens mortos por atropelamento, encontrados mortos ou resultantes da atividade cinegética. A seroprevalência resultante foi de 4.7% e os anticorpos contra MAC foram detetados em raposa vermelha, lontra europeia (Lutra lutra), texugo europeu (Meles meles) e javali. No capítulo III.2 foi desenvolvido um estudo para determinar a ocorrência de MAP em carnívoros selvagens em Portugal, utilizando amostras de 74 animais mortos por atropelamento. A ocorrência de animais infetados foi de 27% (n=20). MAP foi isolado na raposa vermelha, na fuinha (Martes foina), na lontra europeia, no saca-rabos, e no texugo europeu. Nos Capítulos III.3 e III.4 foi demonstrada, pela primeira vez em Portugal, a presença de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) na Lontra europeia. A presença de MAP foi confirmada por cultura bacteriológica e detetada por biologia molecular em múltiplos órgãos. Os capítulos III.5 e III.6 fazem parte de uma série de estudos que pretendem determinar a prevalência da paratuberculose em veados. Com este propósito, foram realizadas necropsias a 877 veados e foram feitas colheitas de vários órgãos para posterior pesquisa de MAP utilizando técnicas de biologia molecular, microbiologia e histopatologia. MAP foi detetado por PCR IS900 em 81.1% das amostras de rim de veado positivas no esfregaço de Ziehl-Neelsen. No Capítulo II.7 pesquisou-se a presença de MAP em 589 javalis e 45 animais foram classificados de infetados por cultura bacteriológica e/ou PCR. De acordo com os nossos resultados, 37.9% dos animais infetados foram aprovados para consumo humano. O Capítulo IV aborda os estudos sobre lesões granulomatosas. Este capítulo está dividido em quatro estudos: nos Capítulos IV.1 e IV.2 foi avaliada a resposta inflamatória crónica nos gânglios mesentéricos de javalis com linfadenite granulomatosa. Os parâmetros morfológicos das lesões foram registados e foi avaliada a expressão dos anticorpos anti-CD3 e anti-CD79α. Os granulomas observados encontram-se principalmente no estadio III e IV e as percentagens e padrões de distribuição de anti-CD3 e anti-CD79α são semelhantes em lesões onde MAP e MTC estão presentes. No Capítulo IV.3 encontra-se descrito, pela primeira vez, a coinfecção por Corynebacterium pseudotuberculosis, Mycobacterium bovis, e MAP confirmada por biologia molecular em veados. No Capítulo IV.4 foram analisados gânglios linfáticos de javalis com linfadenite granulomatosa, mas com resultados negativos na cultura micobacteriana e PCR. Amostras de tecidos foram analisados por PCR e cultura bacteriana para deteção de Nocardia spp. e duas amostras foram positivas para Nocardia spp. em PCR. Este é o primeiro caso documentado de nocardiose em javalis. Estes resultados realçam a necessidade do diagnóstico diferencial das lesões granulomatosas em animais selvagens. O capítulo final (Capítulo V- Conclusões) inclui uma conclusão global da nossa investigação enfatizando os aspetos mais relevantes e significativos. Concluindo, os estudos apresentados neste trabalho pretendem fornecer uma visão mais aprofundada das micobacterioses em mamíferos selvagens. Mycobacterial species are raising serious concerns in livestock and wild animals worldwide. In wildlife, mycobacterial infection has been reported in hundreds of species and likely has the potential to occur in every vertebrate. Since this infection is of a chronic nature the best strategy to control the infection is through early identification of infected animals, and better diagnostic measures are required for effective control programs. With the development of new molecular methods for detecting and characterizing microorganisms, the ecology of mycobacteria has rapidly advanced in all areas. In human medicine, polymerase chain reaction (PCR) assays are accepted diagnostic standards, replacing or complementing culture isolation and acid-fast staining. The mycobacterial species that produce tuberculosis in humans and animals are included in the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC). Mycobacteria from the Mycobacterium avium complex (MAC) cause a variety of diseases including tuberculosis-like disease in humans and birds, disseminated infections in immunocompromised patients, lymphadenitis in humans and mammals and paratuberculosis in ruminants. The aim of the present work was to gain a better understanding of the role of free-living mammalian species in the epidemiology of wildlife mycobacteriosis in Portugal. The present work is structured in five chapters. Chapter I presents a general review of the classification and biology, epidemiology, clinical signs, pathology, diagnostic techniques, and public health concerns of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium complexes in wild mammals. Chapter II focuses on the MTC. This chapter is divided into three studies: Chapter II.1 contains large population surveys of Mycobacterium bovis in Portugal by testing samples from hunted animals and specimens which were found already dead. In this study we investigated 2,116 wild mammals and prevalence by species was: 26.9% in red fox, 20.0% in Egyptian mongoose, 21.4% in wild boar (Sus scrofa) and 38.3% in red deer (Cervus elaphus). These results confirm the presence of Mycobacterium bovis infection in wild carnivores in Portugal. Chapter II.2 confirms the presence of disseminated Mycobacterium bovis in red foxes and it is the first report in the world on natural infection in the brains of these animals. Also for the first time, Chapter II.3 demonstrates Mycobacterium bovis infection in Egyptian mongoose. Chapter III is dedicated to the MAC, and is divided into seven studies: Chapter III.1 analyses the presence of antibodies against MAC in wild mammals killed on roads and by hunters, or found dead in east-central Portugal. The seroprevalence obtained was 4.7% and antibodies against MAC were detected in red fox, Eurasian otter (Lutra lutra), European badger (Meles meles), and wild boar. In Chapter III.2 a survey is conducted to determine the occurrence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in wild carnivores in Portugal by testing samples from 74 road-killed animals. The occurrence of infected animals was 27% (n=20). MAP was isolated in red fox, beech marten (Martes foina), Eurasian otter, Egyptian mongoose and European badger. In Chapter III.3 and III.4 the infection of Eurasian otters with MAP in Portugal is demonstrated for the first time. The presence of MAP was confirmed by isolation in bacteriological culture and detected by molecular methods in multiple organs. Chapter III.5 and III.6 are part of a wider set of studies designed to assess the prevalence of paratuberculosis in free ranging red deer. For that purpose, 877 free-ranging red deer were submitted to necropsy and sampled through molecular methods, microbiology and histopathology. MAP was detected by IS900 PCR in 81.1% of the Ziehl-Neelsen positive kidneys. Chapter III.7 analyses 589 free-ranging wild boar for the presence of MAP and 45 animals were classified as infected, indicated by positivity in the culture and/or in PCR. According to our results, 37.9% of the infected animals were approved for human consumption. Chapter IV focuses on granulomatous lesions. This chapter is divided into four studies: Chapters IV.1 and IV.2 were conducted to evaluate the chronic inflammatory response in the mesenteric lymph nodes of wild boar with granulomatous lymphadenitis. Morphological parameters of the lesions were recorded, and the expression of anti-CD3 and anti-CD79α antibodies was evaluated. The granulomatous lesions consisted mainly in stage III and stage IV granulomas and similar percentages and distribution patterns of CD3 and CD79 occurred in lesions where MAP and MTC were present. In Chapter IV.3 a coinfection of Corynebacterium pseudotuberculosis, M. bovis, and MAP confirmed by molecular methods in red deer is described for the first time. Chapter IV.4 is dedicated to the analysis of wild boar lymph nodes with granulomatous lymphadenitis, but negative to mycobacteria in culture and PCR. Tissues samples were tested by PCR and culture for detection of Nocardia spp. and two samples had positive results for Nocardia spp. in PCR. This is the first documented case of nocardiosis in wild boar. These results emphasize the need for the differential diagnosis of the lymph nodes granulomatous lesions in wild animals. The final Chapter (Chapter V – Concluding remarks) is a comprehensive conclusion of our investigation, emphasizing the most relevant and significant findings. The studies presented in the present work provide further insights into the mycobacterial infections in wildlife mammals. Foundation for Science and Technology (FCT, Portugal).
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