| Summary: | Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica Portugal constitui o limite mais ocidental da distribuição de Pinus sylvestris L. (pinheiro-silvestre). As alterações climáticas globais estão a afetar os ecossistemas florestais estão a ocorrer mais rápido que o tempo necessário à adaptação das árvores. As populações periféricas (situadas em limites de distribuição de uma espécie) têm sido estudadas ao nível da conservação, e constituem reservatórios de elevada diversidade genética intra-específica, além de terem regimes de seleção natural daqueles verificados nas populações centrais. A 'Serra do Gerês' pode ter sido um refúgio para P. sylvestris durante a última era glacial e algumas das populações atuais presentes em áreas ribeirinhas podem ser núcleos remanescentes das potenciais populações nativas. Este trabalho foi desenvolvido no âmbito do projeto da FCT: “Scots pine in Portugal: the Southwest end or just the end” (PTDC/AGR-CFL/110988/2009). O seu principal objetivo foi apoiar ou refutar a hipótese da origem nativa das populações Portuguesas de pinheiro-silvestre localizadas na 'Serra do Gerês' com base em marcadores microssatélite (SSR) (Capítulo II) e na localização física de sequências de DNA repetitivas através de hibridação in situ fluorescente (FISH) não desnaturante (ND-FISH) e FISH (Capítulo III). Durante a presente pesquisa, foram analisados cinco loci SSR cloroplastidiais (cpSSR) e quatro loci nucleares SSR (nSSR) em DNA genómico de 96 indivíduos pertencentes às populações da 'Serra do Gerês' - 'Ribeira das Negras' e 'Biduissa' - e a quatro populações europeias representativas da distribuição desta espécie. Todos os loci nSSR e cpSSR se revelaram altamente polimórficos. A análise Bayesiana identificou um número relevante de clusters K=3. As proporções de mistura da análise Bayesiana e as análises de coordenadas principais diferenciaram as populações Portuguesas entre si e das restantes populações. A totalidade dos dados SSR evidenciou que as populações Portuguesas da 'Serra do Gerês' têm origens diferentes comparativamente às estrangeiras, confirmando a sua origem autóctone. Entre as diversas sequências repetitivas de DNA testadas através de ND-FISH e FISH em esfregaços cromossómicos mitóticos de P. sylvestris de diferentes proveniências, apenas sete SSRs [(AC)10, (AG)10, (AG)12; (AAG)5; (AAC)5; (GATA)4; (GACA)5 e (GGAT)4]; a repetição telomérica (TTTAGGG)6 e a 45S rDNA hibridaram com sucesso. Os padrões de hibridação foram semelhantes entre diferentes proveniências. Apesar da inexistência de estudos citogenéticos ou ideograma anteriores baseados em SSRs para pinheiro-silvestre, construi-se o esboço de um ideograma com base na sequencia SSR (AG)10, que revelou o maior número de sinais de hibridação. Experiências FISH adicionais estão previstas para identificar inequivocamente todos os cromossomas individuais. Inesperadamente, a sonda telomérica revelou uma distribuição dispersa e intersticial nos cromossomas. A sonda 45S rDNA detetou 14 loci rDNA corroborando estudos anteriores desenvolvidos em P. sylvestris. Contrariamente aos dados moleculares, os marcadores citogenéticos não contribuíram para a resposta à hipótese inicial. Contudo, o presente estudo citogenético constituiu o primeiro esboço de um ideograma para P. sylvestris baseado em sondas SSR e na discriminação de populações nativas e/ou raças geográficas de pinheiro-silvestre por marcadores citogenéticos. Pinus sylvestris L. (Scots pine) is widely distributed across Eurasia, ranging from southern Iberian Peninsula to beyond the Arctic Circle. Portugal constitutes the rear-end limit of its distribution. The foreseen global climate changes may jeopardize the adaptation of forest ecosystems since the process of change is rather fast in contrast to the time frame of trees. Peripheral and rear-end populations have become relevant for conservation biologists. They constitute a reservoir of intra-specific genetic diversity and experienced different natural selection regimes relatively to central populations. ‘Serra do Gerês’ might constitute a refuge for P. sylvestris during the last glacial age and present populations, at some riparian areas, could be remnant nuclei of putative native populations. This work was developed under the scope of the FCT project “Scots pine in Portugal: the Southwest end or just the end” (PTDC/AGR-CFL/110988/2009). Its major goal was to verify if the Portuguese Scots pine populations of ‘Serra do Gerês’ are in fact native, based on simple sequence repeat (SSR) markers (Chapter II) and physical location of repetitive DNA sequences by nondenaturing fluorescence in situ hybridization (ND-FISH) and FISH (Chapter III). During the present research, cloroplastidial SSR (cpSSR) loci and four nuclear SSR (nSSR) loci were analyzed five on genomic DNA from 96 individuals belonging to two Scots pine populations of ‘Serra do Gerês’ - ‘Ribeira das Negras’ and ‘Biduissa’, and four foreign populations representative of this species distribution. Both nSSR and cpSSR loci revealed to be highly polymorphic. Bayesian analysis identified a relevant number of K=3 clusters. The admixture proportions of the Bayesian analysis and the Principal Coordinate Analyses differentiated the Portuguese populations from each other and from the remaining populations. The pool of the SSR data provided evidences that the Portuguese populations have different origins comparatively to the foreign ones, supporting their native origin. Among the several repetitive DNA sequences tested by ND-FISH and FISH experiments performed in mitotic chromosome spreads of P. sylvestris from different provenances, seven SSRs [(AC)10; (AG)10; (AG)12; (AAG)5; (AAC)5; (GATA)4; (GACA)5 and (GGAT)4], the telomeric (TTTAGGG)6 and the 45S ribosomal DNA (rDNA) probes successfully hybridized. The hybridization patterns were similar among different provenances. Although there are no previous cytogenetic studies or ideograms based on SSRs for P. sylvestris, was attempted the construction of an ideogram for the probe SSR (AG)10 which showed the highest number of hybridization signals. Additional FISH experiments are envisaged in order to identify unequivocally all individual chromosomes. Unexpectedly, the telomeric probe showed an interspersed distribution along the chromosomes. The 45S rDNA probe detected 14 rDNA loci corroborating previous studies developed in P. sylvestris. Conversely to the molecular data, the cytogenetic markers did not aid to answer the initial hypothesis. However, the present cytogenetic study constituted the first attempt of an ideogram construction for P. sylvestris based on SSRs and discrimination of native populations and/or geographic races of this species by cytogenetic markers.
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