| Summary: | HMGA2 behoort tot de familie van de High Mobility Group A (HMGA) chromos omale eiwitten die worden beschouwd als architecturale transcriptiefacto ren die naast drie DNA-bindende AT-haken, een C-terminale zure staart be zitten. De expressie van het HMGA2-gen wordt geregeld tijdens de o ntwikkeling. De expressie is hoog tijdens de embryonale ontwikkeling en daalt zeer sterk na de geboorte. Inactivering van het Hmga2-gen in muizen leidt tot een pygmee-fenotype. Dit fenotype wordt gekarakterisee rd door een groeivertraging en een drastische vermindering in vetweefsel . In veel humane tumoren is er een breuk in, of een foutieve expressie v an het HMGA2-gen. Dit maakt dat het HMGA2-gen vermoedelijk h et meest frequent herschikte gen is in goedaardige humane tumoren. Chrom osomale translocaties veroorzaken vaak een verbreking van het HMGA2</ >-gen in goedaardige tumoren van mesenchymale oorsprong zoals lipomen, p leiomorfe adenomen van de speekselklier, leiomyomen van de uterus, borst - en longhamartomen, angiomyxomen en poliepen van het endometrium. Deze translocaties leiden tot de expressie van fusietranscripten die coderen voor het DNA-bindende domein van HMGA2 gekoppeld aan verschillende ectop ische sequenties afkomstig van translocatiepartnergenen. Meestal voegen deze ectopische sequenties maar een korte sequentie toe aan het leesraam van het HMGA2-transcript, wat resulteert in expressie van een get runceerd eiwit (HMGA2Tr) dat enkel de DNA-bindende domeinen van HMGA2 be vat. Hoewel het HMGA2-eiwit een zeer belangrijke rol speelt bij normale celgroei tijdens de embryonale ontwikkeling en bij abnormale groei in go edaardige en kwaadaardige tumoren, zijn de mechanismen die hiervoor vera ntwoordelijk zijn tot dusver ongekend. Met het werk dat in deze thesis is beschreven, hebben we meer inzicht ve rkregen in de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij HMGA2-gerel ateerde groeiregulatie. We beantwoordden deze vraag door expressieprofie len te vergelijken met microarray analyses. Om nieuwe doelwitgenen van H MGA2 te identificeren, maakten we gebruik van twee verschillende benader ingen. In eerste instantie zochten we naar in vivo doelgenen van wild-typ e Hmga2 in de context van zijn rol tijdens de embryonale ontwikkeling. H iertoe maakten we gebruik van E12.5 embryo’s afkomstig van een natuurlij ke muizenlijn die geen Hmga2 tot expressie brengt (pg/pg). Vergeli jking van het expressieprofiel tussen E12.5 wild-type- en pg/pg-em bryo’s leerde dat de expressie van één van de klonen die differentieel t ot expressie kwamen even sterk verminderd was in pg/pg-embryo’s al s de expressie van Hmga2. Daarom werd deze kloon geselecteerd voor verder onderzoek. De sequentie van deze kloon kwam overeen met de seque ntie van het Insulin-like growth factor II mRNA-binding protein 2 gen. IMP2 behoort tot een familie van drie mRNA-bindende eiwitten die st erk en specifiek kunnen binden aan RNA. Ze zijn betrokken bij post-trans criptionele processen zoals lokalisatie, stabiliteit en translationele c ontrole van mRNA’s. Net zoals HMGA2 komen de IMP-eiwitten vooral tot exp ressie tijdens de embryonale ontwikkeling en komen ze opnieuw tot expres sie in verscheidene humane tumoren. De sterk gereduceerde Imp2-exp ressie in Hmga2-dificiënte embryo’s werd bevestigd door middel van Northern blot analyse. Hiervoor werd RNA gebruikt afkomstig van genetis ch gemanipuleerde E12.5 Hmga2-/-- en Hmga2+/+-embryo’s. Met deze techniek toonden we ook aan dat enkel de expressie van Imp2, en niet die van de familieleden Imp1 en Imp3, verschilde tus sen Hmga2-/-- en Hmga2+/+-embryo’s. We onderzochten de relevantie van de expressieregulatie van het IMP2< />-gen door HMGA2 in primaire humane tumoren. Uit onze resultaten kunnen we besluiten dat er in de tumoren die we onderzochten een tendens is vo or een correlatie tussen HMGA2- en IMP2-expressie. In tweede instantie zochten we naar doelgenen van de tumorspecifieke vor m van HMGA2 die het meest gevonden werd in goedaardige tumoren van mesen chymale oorsprong. Hiervoor maakten we gebruik van een in vitro sy steem bestaande uit een muizen NIH/3T3-fibroblastencellijn die het HMGA2 Tr-eiwit tot overexpressie brengt. Dit eiwit bevat enkel de DNA-bindende AT-haken van HMGA2. Ook in deze studie identificeerden we het IMP2</ >-gen. Maar, in tegenstelling tot het positieve effect van het wild-type HMGA2-eiwit op de expressie van IMP2, blijkt de tumorspecifieke v orm van HMGA2 een negatief effect te hebben op de expressie van IMP2< />. De belangrijkste boodschap uit het eerste deel van deze thesis is dat we het Imp2-gen identificeerden als een gen dat mogelijk een zeer be langrijke rol speelt tijdens de embryonale ontwikkeling. Daarenboven zou de HMGA2-IMP2-relatie sterk verstoord kunnen zijn in tumoren die het wi ld-type HMGA2, of het tumorspecifieke getrunceerde HMGA2-eiwit, tot expr essie brengen. In het tweede deel van deze studie trachtten we het effect van HMGA2- en HMGA2Tr-eiwitten op de expressie van het IMP2-gen verder te onder zoeken. Tijdens onze zoektocht naar mogelijke regulatoire regio’s in het Imp2-gen, vonden we twee regio’s die in staat zijn om de expressi e van een luciferase reportergen te beïnvloeden. De eerste regio b evat zowel de vermeende transcriptiestartplaats als het ATG-translatie i nitiatiecodon. De tweede regio ligt in het intron tussen de twee eerste coderende exonen van het Imp2-gen. We toonden aan dat zowel HMGA2 als HMGA2Tr de expressie van het Imp2-gen beïnvloeden via de tweed e regio. Door middel van EMSA toonden we aan dat het wild type HMGA2-eiw it bindt aan een 51 bp AT-rijk fragment dat gelegen is in de intronische regio. De binding van HMGA2 aan de regulatoire regio werd in vivo bevestigd door middel van chromatine-immunoprecipitatie. Onze resultaten tonen aan dat HMGA2, en zeer waarschijnlijk HMGA2Tr, hun belangrijkste effect op de IMP2-gen expressie uitoefenen via de s terk geconserveerde AT-rijke regio. IMP2 is het minst gekarakteriseerde lid van de IMP-familie. In het derde deel van deze thesis werd het IMP2-eiwit verder gekarakteriseerd met be trekking tot een aantal eigenschappen die belangrijk bleken voor de biol ogische functie van de IMP-eiwitten in zoogdier, kip en Xenopus. We iden tificeerden twee functionele nucleaire exportsignalen en beschreven de s ubcellulaire lokalisatie van IMP2. Het cytoplasmatisch gelokaliseerde IM P2-eiwit vertoont een granulaire intracellulaire lokalisatie. Verder lij kt het eiwit gedeeltelijk geassocieerd te zijn met microtubuli. In motie le cellen is er daarenboven een partiële lokalisatie van het eiwit in la mellipodia. Onze data plaatsen het IMP2-eiwit in een model waarin het eiwit pendelt naar de kern, RNA bindt en vervolgens het RNA in de vorm van ribonucleop roteïne-partikels via het cytoskelet naar specifieke subcellulaire compa rtimenten transporteert waar het RNA nodig is voor, bijvoorbeeld, lokale eiwitsynthese. status: published
|
|---|