| Summary: | Curs 2022-2023 Títol: Estudi de l’eficàcia d’un vector episomal amb seqüència PARS i marcador de selecció basat en la font de carboni en Pichia pastoris Autora: Maria Sánchez Co-Tutores: Dr. Xavi Garcia Ortega (DEQBA – UAB) i Dra. Montserrat Capellas Herms (UVic-UCC) Data: Juny de 2023 Paraules clau: Pichia pastoris, bioprocés, vectors d’expressió, vector episomal, marcadors de selecció Els cassets d’expressió per la producció de proteïnes recombinants, generalment, s’integren en llocs concrets del genoma, obtenint soques d’expressió estables. No obstant, el llevat Pichia pastoris presenta variabilitat clonal, fent que el lloc d’integració del vector en el genoma sigui, sovint, diferent en totes les cèl·lules transformades. Aquesta diferència provoca usualment discordances en els rendiments de producció entre els diferents clons, fent necessàries tècniques de high-thoughput screening per la selecció dels millors clons. En aquest treball, s’avalua l’eficàcia d’un vector episomal creat dins del projecte CD-Lab (TU Graz, Àustria) capaç de replicar-se ell sol sense la necessitat d’integrar-se en el genoma. Aquesta opció evita la variabilitat clonal i permet la preparació ràpida de soques amb elevada productivitat i rendiments, reduint costos i temps. No obstant això, requereixen un marcador de selecció constant per mantenir-se dins de l’organisme. En aquest cas, s’utilitza el gen GUT1, imprescindible per la metabolització del glicerol. Es realitzen cultius en fed-batch amb les mateixes condicions per comparar els resultats entre soques amb el plasmidi episomal i soques amb el mateix plasmidi integrat en el genoma. També, s’analitza el funcionament del promotor PCAT1. Així doncs, es mesuren diferents paràmetres com biomassa, paràmetres respiratoris, anàlisis d’HPLC i d’activitat enzimàtica, així com altres valors on-line del fermentador. Els resultats obtinguts dels cultius amb el vector episomal presenten productivitats de proteïna model, la lipasa de Candida antartica B (CalB), més elevades que els cultius de ...
|
|---|