| Summary: | My work describes two sectors of the human bacterial environment: 1. The sources of exposure to infectious non-tuberculous mycobacteria. 2. Bacteria in dust, reflecting the airborne bacterial exposure in environments protecting from or predisposing to allergic disorders. Non-tuberculous mycobacteria (NTM) transmit to humans and animals from the environment. Infection by NTM in Finland has increased during the past decade beyond that by Mycobacterium tuberculosis. Among the farm animals, porcine mycobacteriosis is the predominant NTM disease in Finland. Symptoms of mycobacteriosis are found in 0.34 % of slaughtered pigs. Soil and drinking water are suspected as sources for humans and bedding materials for pigs. To achieve quantitative data on the sources of human and porcine NTM exposure, methods for quantitation of environmental NTM are needed. We developed a quantitative real-time PCR method, utilizing primers targeted at the 16S rRNA gene of the genus of Mycobacterium. With this method, I found in Finnish sphagnum peat, sandy soils and mud high contents of mycobacterial DNA, 106 to 107 genome equivalents per gram. A similar result was obtained by a method based on the Mycobacterium-specific hybridization of 16S rRNA. Since rRNA is found mainly in live cells, this result shows that the DNA detected by qPCR mainly represented live mycobacteria. Next, I investigated the occurrence of environmental mycobacteria in the bedding materials obtained from 5 pig farms with high prevalence (>4 %) of mycobacteriosis. When I used for quantification the same qPCR methods as for the soils, I found that piggery samples contained non-mycobacterial DNA that was amplified in spite of several mismatches with the primers. I therefore improved the qPCR assay by designing Mycobacterium-specific detection probes. Using the probe qPCR assay, I found 105 to 107 genome equivalents of mycobacterial DNA in unused bedding materials and up to 1000 fold more in the bedding collected after use in the piggery. This result shows that there was a source of mycobacteria in the bedding materials purchased by the piggery and that mycobacteria increased in the bedding materials during use in the piggery. Allergic diseases have reached epidemic proportions in urbanized countries. At the same time, childhood in rural environment or simple living conditions appears to protect against allergic disorders. Exposure to immunoreactive microbial components in rural environments seems to prevent allergies. I searched for differences in the bacterial communities of two indoor dusts, an urban house dust shown to possess immunoreactivity of the TH2-type and a farm barn dust with TH1-activity. The immunoreactivities of the dusts were revealed by my collaborators, in vitro in human dendritic cells and in vivo in mouse. The dusts accumulated >10 years in the respiratory zone (>1.5 m above floor), thus reflecting the long-term content of airborne bacteria at the two sites. I investigated these dusts by cloning and sequencing of bacterial 16S rRNA genes from dust contained DNA. From the TH2-active urban house dust, I isolated 139 16S rRNA gene clones. The most prevalent genera among the clones were Corynebacterium (5 species, 34 clones), Streptococcus (8 species, 33 clones), Staphylococcus (5 species, 9 clones) and Finegoldia (1 species, 9 clones). Almost all of these species are known as colonizers of the human skin and oral cavity. Species of Corynebacterium and Streptococcus have been reported to contain anti-inflammatory lipoarabinomannans and immunmoreactive beta-glucans respectively. Streptococcus mitis, found in the urban house dust is known as an inducer of TH2 polarized immunity, characteristic of allergic disorders. I isolated 152 DNA clones from the TH1-active farm barn dust and found species quite different from those found from the urban house dust. Among others, I found DNA clones representing Bacillus licheniformis, Acinetobacter lwoffii and Lactobacillus each of which was recently reported to possess anti-allergy immunoreactivity. Moreover, the farm barn dust contained dramatically higher bacterial diversity than the urban house dust. Exposure to this dust thus stimulated the human dendritic cells by multiple microbial components. Such stimulation was reported to promote TH1 immunity. The biodiversity in dust may thus be connected to its immunoreactivity. Furthermore, the bacterial biomass in the farm barn dust consisted of live intact bacteria mainly. In the urban house dust only ~1 % of the biomass appeared as intact bacteria, as judged by microscoping. Fragmented microbes may possess bioactivity different from that of intact cells. This was recently shown for moulds. If this is also valid for bacteria, the different immunoreactivities of the two dusts may be explained by the intactness of dustborne bacteria. Based on these results, we offer three factors potentially contributing to the polarized immunoreactivities of the two dusts: (i) the species-composition, (ii) the biodiversity and (iii) the intactness of the dustborne bacterial biomass. The risk of childhood atopic diseases is 4-fold lower in the Russian compared with the Finnish Karelia. This difference across the country border is not explainable by different geo-climatic factors or genetic susceptibilities of the two populations. Instead, the explanation must be lifestyle-related. It has already been reported that the microbiological quality of drinking water differs on the two sides of the borders. In collaboration with allergists, I investigated dusts collected from homes in the Russian Karelia and in the Finnish Karelia. I found that bacterial 16S rRNA genes cloned from the Russian Karelian dusts (10 homes, 234 clones) predominantly represented Gram-positive taxa (the phyla Actinobacteria and Firmicutes, 67%). The Russian Karelian dusts contained nine-fold more of muramic acid (60 to 70 ng mg-1) than the Finnish Karelian dusts (3 to 11 ng mg-1). Among the DNA clones isolated from the Finnish side (n=231), Gram-negative taxa (40%) outnumbered the Gram-positives (34%). Out of the 465 DNA clones isolated from the Karelian dusts, 242 were assigned to cultured validly described bacterial species. In Russian Karelia, animal-associated species e.g. Staphylococcus and Macrococcus were numerous (27 clones, 14 unique species). This finding may connect to the difference in the prevalence of allergy, as childhood contacts with pets and farm animals have been connected with low allergy risk. Plant-associated bacteria and plant-borne 16S rRNA genes (chloroplast) were frequent among the DNA clones isolated from the Finnish Karelia, indicating components originating from plants. In conclusion, my work revealed three major differences between the bacterial communtites in the Russian and in the Finnish Karelian homes: (i) the high prevalence of Gram-positive bacteria on the Russian side and of Gram-negative bacteria on the Finnish side and (ii) the rich presence of animal-associated bacteria on the Russian side whereas (iii) plant-associated bacteria prevailed on the Finnish side. One or several of these factors may connect to the differences in the prevalence of allergy. Työni kuvailee ihmisen bakteeriympäristön kahta osa-aluetta: 1. Ympäristöstä tarttuvien ei-tuberkuloottisten mykobakteerien lähteitä. 2. Pölyn bakteereita ihmisen ilmavälitteisen altistuksen kuvaajina allergialta suojaavissa ja allergialle altistavissa ympäristöissä. Ei-tuberkuloottiset mykobakteerit (non-tuberculous mycobacteria, NTM) tarttuvat ihmisiin ja eläimiin ympäristöstä. NTM:en aiheuttamat infektiot ovat lisääntyneet Suomessa viimeisen vuosikymmenen aikana ylittäen varsinaisen tuberkuloosin (Mycobacterium tuberculosis -infektioiden) määrän. Sian mykobakterioosi on yleisin tuotantoeläinten mykobakteeritauti Suomessa. Mykobakteeri-infektioon viittaavia muutoksia tavataan keskimäärin 0.34 %:lla teurastetuista sioista. Epäiltyjä NTM-infektiolähteitä ihmiselle ovat maaperä ja juomavesi ja sioille kuivikkeet. Ihmisen ja sian mykobakteeri-infektioiden lähteiden tunnistaminen vaatii kvantitatiivisia menetelmiä. Me kehitimme kvantitatiivisen PCR-menetelmän (qPCR), joka perustui Mycobacterium -suvun bakteereiden 16S rRNA geeneihin kohdistetuiden alukkeiden käyttöön. Löysin tällä menetelmällä suomalaisesta turve-, hiekka- ja mutamaista mykobakteeri DNA:ta korkeina pitoisuuksina, 106 - 107 genomiyksikköä grammaa maata kohti. Vastaava tulos saatiin myös menetelmällä, joka perustui mykobakteerispesifiseen 16S RNA-hybridisointiin. Koska tätärRNA:ta esiintyy pääasiassa elävissä soluissa, saatu tulos osoittaa että qPCR:n avulla mitattu DNA oli pääasiassa peräisin elävistä mykobakteereista. Tutkin seuraavaksi mykobakteereiden esiintyvyyttä kuivikemateriaaleissa viidellä sikatilalla jotka valittiin suuren (>4 %) mykobakterioosiesiintyvyyden perusteella. Käyttäessäni edellä kuvattua qPCR menetelmää maaperän ja sikalakuivikkeiden tutkimiseen löysin kuivikemateriaaleista korynebakteerien DNA:ta joka monistui käyttämälläni qPCR menetelmällä huolimatta useista epäpariutuvuuksista PCR-alukkeiden kanssa. Tästä syystä paransin qPCR-menetelmää suunnittelemalla mykobakteereille spesifiset hybridisointikoettimet. Koetinmenetelmän avulla löysin käyttämättömistä kuivikkeista 105 - 107 genomiyksikköä mykobakteeri-DNA:ta grammaa kohti ja sikaloissa käytön jälkeen jopa tuhat kertaa suurempia pitoisuuksia. Tulokset osoittavat että sikaloihin hankituissa kuivikkeissa oli mykobakteerilähde ja että mykobakteerit lisääntyivät kuivikkeen sikalakäytön aikana. Allergiset sairaudet ovat yleisiä kaupungistuneissa maissa. Samanaikaisesti maatalousympäristössä tai vaatimattomissa oloissa vietetty lapsuus liittyy matalampaan allergiariskiin. Maatilaympäristön immuunivaikuttavien mikrobituotteiden uskotaan estävän allergian kehittymistä. Hain työssäni eroja kahden sisätilapölyn, TH2 immunoreaktiivisen kaupunkiasuntopölyn ja TH1 -immunoreaktiivisen maatilapölyn, bakteerikoostumusten välillä. Yhteistyökumppanini olivat selvittäneet pölyjen immuunivaikutukset in vitro ihmisen dendriittisoiluissa ja in vivo hiiressä. Tutkitut pölyt olivat kertyneet tutkimuskohteissa hengityskorkeudella (> 1,5 m lattian yläpuolella) yli kymmenen vuoden kuluessa ja siten edustivat hengitysilman bakteerikoostumuksen pitkäaikaista keskiarvoa. Tutkin pölyjä kloonaamalla ja sekvensoimalla bakteerien 16S rRNA geenejä pölyjen sisältämästä DNA:sta. Eristin TH2-immunoreaktiivisesta kaupunkiasuntopölystä 139 DNA-kloonia. Yleisimmät bakteerisuvut kloonien joukossa olivat Corynebacterium (5 lajia, 34 kloonia), Streptococcus (8 lajia, 33 kloonia), Staphylococcus (5 lajia, 9 kloonia) and Finegoldia (1 lajia, 9 kloonia). Lähes kaikki näistä lajeista tunnetaan ihmisen ihon ja suuontelon asukkaina. Corynebacterium -lajien on todettu sisältävän anti-inflammatorisia lipoarabinomannaaneja ja Streptococcus -lajien immunoreaktiivisia betaglukaaneja. Kaupunkiasuntopölystä löytynyt Streptococcus mitis -lajin tiedetään aiheuttavan allergisille sairauksille tunnusomaisen TH2-tyyppisen immunireaktion. Eristin TH1-immunoreaktiivisesta maatilapölystä 152 DNA-kloonia ja löysin hyvin erilaisia bakteerilajeja kuin kaupunkipölystä. Löysin mm. klooneja, jotka edustivat Bacillus licheniformis, Acinetobacter lwoffii and Lactobacillus -lajeja, joiden on todettu omaavan allergiaa ehkäiseviä immuunivaikutuksia. Bakteeriyhteisö maatilapölyssä oli huomattavasti monimuotoisempi kuin kaupunkiasuntopölyssä. Maatilapöly näinollen altisti ihmisen dendriittisolut yhtäaikaisesti useille erilaisille mikrobikomponenteille. Tällaisen altistuksen on todettu edistävän TH1-immuniteetin syntyä. Pölyn mikrobiologinen monimuotoisuus ja immuunivaikutukset saattavat siis liittyä toisiinsa. Mikroskopointi ositti, että maatilapölyn bakteeribiomassa koostui pääasiassa ehjistä elävistä soluista. Kaupunkiasuntopölyn bakteeribiomassasta vain likimäärin 1 % koostui ehjistä soluista. Hajonneiden solujen immuunireaktiivisuus voi poiketa ehjien solujen aktiivisuudesta. Tämä todettiin hiljattain homeilla. Mikäli sama pätee bakteerilla, tutkimieni pölyjen erilaiset immuunivaikutukset voivat selittyä pölyjen bakteeribiomassan eheydellä. Tarjoamme edellä esitettyjen tulosten perusteella kolmea mahdollista tekijää selittämään pölyjen vastakohtaisia immuunivaikutuksia: (i) bakteeribiomassan lajikoostumus, (ii) lajiston monimuotoisuus sekä (ii) bakteerisolujen eheys. Lapsuusajan atooppisten sairauksien riski on Venäjän Karjalassa vain neljäsosa siitä mitä se on Suomen Karjalassa. Tämä ero ei selity luonnonmaatieteellisillä olosuhteilla tai eroilla väestöjen perinnöllisissä alttiuksissa. Eron täytyy siten liittyä elämäntapoihin. Juomaveden mikrobiologisen laadun on jo todettu eroavan huomattavasti Venäjän ja Suomen Karjalan välillä. Tutkin Venäjän ja Suomen Karjalan kodeista kerättyjä huonepölyjä yhteistyössä allergiatutkijoiden kanssa. Havaitsin, että Venäjän Karjalan kotipölyistä eristetyt DNA-kloonit (10 kotia, 234 kloonia) edustivat pääasiassa Gran-positiivisia bakteereita (pääluokat Firmicutes ja Actinobacteria). Venäjän Karjalan pölyt sisälsivät myös yhdeksän kertaa enemmän muramiinihappoa (60 - 70 ng mg-1) kuin Suomen puolelta kerätyt pölyt (3 - 11 ng mg-1). Suomen Karjalan kotipölyistä eristettyjen DNA kloonien joukossa esiintyi runsaammin Gram-negatiivisten (40 %) kuin Gram positiivisten (34 %) bakteeriryhmien edustajia. Venäjän ja Suomen Karjalan kotipölyistä eristetyistä DNA klooneista (n=465) 242 tunnistui viljellyn, validisti kuvatun bakteerilajin edustajaksi. Eläimille ominaiset bakteerilajit, mm. Staphylococcus ja Macrococcus -lajit, olivat yleisiä Venäjän Karjalan pölyissä (27 kloonia, 14 ominaista lajia). Tämä löydös voi liittyä Venäjän puolen matalaan allergiariskin, sillä lapsuusajan altistuksen koti- ja tuotantoeläimille on todettu vähentävän allergiariskiä. Kasveille ominaiset bakteerilajit ja kasviperäiset viherhiukkasten 16S rRNA geenit olivat runsaasti edustettuina Suomen Karjalan pölyissä. Tulos kertoo kasviperäiseen aineksen osuudesta pölyissä. Työni osoitti kolme merkittävää eroa Venäjän ja Suomen Karjalan kotipölyjen bakteerikoostumusten välillä: (i) Gram-positiivisten bakteerien suuri osuus Venäjän puolella ja Gram-negatiivisten suuri osuus Suomen puolella, (ii) eläimille ominaisten bakteerien suuri määrä Venäjän Karjalan pölyissä ja (iii) kasveille ominaisten bakteerien yleisyys Suomen Karjalan kotipölyissä. Yksi tai useat näistä tekijöistä voivat liittyä allergiariskin eroihin Venäjän ja Suomen Karjalan välillä.
|
|---|