In situ hybridisering for deteksjon av cytokrom P450 1A i presisjonskuttede leverskiver (PCLS) fra atlanterhavstorsk (Gadus morhua)

• Main Author: Nohre, Marie
• Format: Master Thesis
• Language: Bokmål
• Published: The University of Bergen 2016
• Subjects: Gadus morhua; cyp1a; ISH; in situ hybridisering; cytokrom p450 1a; presisjonskuttede leverskiver; PCLS; beta-naftoflavone; BNF; 751999; Burch; Eide; Lever; atlanterhavstorsk
• Online Access: http://hdl.handle.net/1956/12621

Marine arter og økosystemer blir utsatt for menneskeskapte stoffer fra en rekke ulike kilder. Siden de biologiske effektene for mange av disse stoffene ikke er godt karakterisert er det derfor behov for gode og effektive metoder for å studere effektene av nye, kjente og også blandinger av disse forbindelsene. Atlanterhavstorsken (Gadus morhua) er en økonomisk og økologisk svært viktig art i Nord- Atlanteren. Torskegenomet ble i 2011 sekvensert og annotert (Star et al., 2011) og atlanterhavstorsken er slik en viktig modellorganisme for økotoksikologiske studier. I tråd med 3R-prinsippet (Russell og Burch, 1959) ble det nylig utviklet en metode for å tillage presisjonskuttede leverskiver (PCLS) på torsk (Eide et al., 2014). Dette er ett in vitro system som muliggjør eksponeringsforsøk for ulike miljøgifter og også blandinger av slike. Målet for denne oppgaven har vært å utvikle en prosedyre for in situ hybridisering (ISH) på PCLS og studere den cellulære lokalisasjonen av cytokrom P450 1A (CYP1A) ved eksponering for β-naftoflavon (BNF). Oppgaven viser at det på grunn av torskens høye fettinnhold er nødvendig å støpe leveren inn i et hydrofobisk materiale, slik som parafin, ved kutting av snitt til histologii eller ISH analyser. ISH av cyp1a i PCLS antyder en homogen bakgrunnsuttrykning av transkriptet i ueksponert lever og en induksjon og mer heterogen uttrykning av CYP1A etter eksponering for BNF. CYP1A er en av de viktigste biomarkørene for oljerelaterte forbindelser, men denne metoden kan også benyttes til å studere tilstedeværelsen av andre transkripter og biomarkører. ISH på PCLS muliggjør deteksjon og cellulær lokalisering av RNA og DNA og er slik en god støtte til immunohistokjemi (IHC), da det ofte ikke er tigjengelig et egnet antistoff til proteinet man vil studere. Ved hjelp av det sekvenserte og annoterte torskegenomet (Star et al., 2011) og grunnleggende molekylærbiologiske metoder kan man produsere ønskede prober og gjennomføre ISH analyser på torskelever som beskrevet i denne oppgaven. Master i ...