| Summary: | The aim of this study was to produce and purify the E3-14.7K adenovirus protein and its intracellular FIP-1 protein, in order to study their molecular interactions, their relationship with microtubules, and respective implication in apoptosis cycle. For this purpose, we have produced and purified five recombinants proteins: GST-FIP-1, E3-14.7K, and their fluorescent counterparts: EGFP-FIP-1, Cherry-FIP-1 and E3-Cherry, fused with EGFP or Cherry labels. We have constructed the pGST-FIP-1 plasmid by cloning the FIP-1 gene into the pGEX-6P-2 vector, in order to purify GST-FIP-1 protein by affinity chromatography with, GST BindTM Kits (Novagen). By this technique, this protein was purified with 95% of purity. All the other proteins, containing a 6 His-tag, were purified by affinity chromatography using His.Bind® Purification Kit (Novagen) based on an immobilized metal affinity chromatography (IMAC) method in native conditions. All these proteins were expressed in Escherichia coli Arctic ExpressTM competent cells. Typically it was observed that E3-14.7K protein forms inclusion bodies but the protein was successfully purified with 91% of purity when the extraction was performed in the presence of 0.5 M urea. The purification of the fluorescent proteins (EGFP-FIP-1, E3-Cherry and Cherry-FIP-1) failed to remove all contaminants, however their fluorescent properties exhibited a good emission spectrum. These fluorescent proteins will be of particular interest for studying their intracellular trafficking and interactions by confocal microscopy. These will constitute innovative tools for future researches, especially concerning to the apoptosis cycle. O objectivo deste trabalho consiste em produzir e purificar a proteína E3-14.7K e a proteína intracelular FIP-1, com o fim de estudar as suas interacções moleculares, a relação com os microtubulos e a sua respectiva implicação na apoptose. Para este efeito, produziu-se e purificou-se cinco proteínas recombinantes: GST-FIP-1, E3-14.7K, proteínas homologas fluorescentes nomeadamente: EGFP - FIP-1, Cherry-FIP-1 e E3- Cherry. A construção do plasmídeo pGST-FIP-1 foi realizada clonando o gene FIP-1 e inserindo-o no vector pGEX-6P-2, com fim de purificar a proteína GST-FIP-1 através de cromatografia afinidade com GST BindTM Kits (Novagen). Através desta técnica, a proteína foi purificada com 95% de pureza. Todas as outras proteínas, contendo a 6 Histag, foram purificados por cromatografia de afinidade utilizando His.Bind® Purification Kit (Novagen) baseado na immobilized metal affinity chromatography (IMAC) em condições nativas. Todas estas proteínas foram expressas em Escherichia coli Arctic ExpressTM competent cells. Neste trabalho observou-se que a proteína E3-14.7K forma habitualmente corpos de inclusão, no entanto foi purificada com sucesso, em cerca de 91% de pureza. A sua extracção foi realizada em presença de uma concentração de 0.5 M de ureia. Na purificação das proteínas fluorescentes (EGFP-FIP-1, E3-Cherry e Cherry-FIP-1) não foi possível remover todos os contaminantes presentes, no entanto conseguiu-se obter um espectro de emissão de fluorescência razoável. Estas proteínas têm um particular interesse, para o estudo das suas interacções, no tráfico intracelular através da microscopia confocal, o que consiste numa inovação na investigação, especialmente em relação à apoptose.
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