Optimizacija vozlišča v izbranem tri-vozliščnem Turingovem genetskem vezju, vgrajenem v Escherichia coli
Nastanek in razvoj živega organizma predstavlja veliko uganko in eno najbolj perečih vprašanj v biologiji. V nastanek novih celic, njihovo delitev, diferenciacijo in zmožnost oblikovanja višjih funkcionalnih sistemov je vključenih mnogo bioloških mehanizmov. Eden od teh je nastanek in tvorba Turingo...
| Main Author: | |
|---|---|
| Other Authors: | |
| Format: | Master Thesis |
| Language: | Slovenian |
| Published: |
2020
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?id=117292 https://repozitorij.uni-lj.si/Dokument.php?id=131118&dn= https://repozitorij.uni-lj.si/Dokument.php?id=131119&dn= https://repozitorij.uni-lj.si/Dokument.php?id=131120&dn= |
| Summary: | Nastanek in razvoj živega organizma predstavlja veliko uganko in eno najbolj perečih vprašanj v biologiji. V nastanek novih celic, njihovo delitev, diferenciacijo in zmožnost oblikovanja višjih funkcionalnih sistemov je vključenih mnogo bioloških mehanizmov. Eden od teh je nastanek in tvorba Turingovih vzrocev. Idejo o Turingovih vzorcih je leta 1952 v znanstveni publikaciji z naslovom Kemična osnova morfogeneze predstavil britanski matematik Alan Turing. V svojem delu je opisal model reakcije in difuzije, s pomočjo katerega lahko razložimo nastanek nekaterih vzorcev, ki jih v naravi vidimo kot zebrine proge, vzorce na tropskih ribah, na kožuhu leopardov, gepardov in drugih živali. Ideja Turingovega modela temelji na reakciji med dvema spojinama, imenovanima morfogena. V Turingovem modelu je eden od morfogenov aktivator, ki je sposoben aktivacije samega sebe in drugega morfogena. Druga spojina deluje kot inhibitor in zavira nastajanje prve spojine. Če v sistemu difuzija ni prisotna, se po določenem času vzpostavi stabilno stanje, v katerem sta koncentraciji aktivatorja in inhibitorja teoretično enaki. Ko sistemu dodamo difuzijo, pride do destabilizacije, kar omogoča tvorbo Turingovih vzorcev. Ti so vidni kot periodično pojavljajoče se črte ali vzorci drugih oblik. Za nastanek Turingovih vzorcev je pomembno, da inhibitor difundira veliko hitreje kot aktivator, njihov pojav pa lahko opazujemo le, kadar zagotovimo pravilno in zelo specifično kombinacijo parametrov, kot so stopnja proizvodnje in stopnja razgradnje morfogenov, geometrija sistema, razpolovni čas molekul, ki reagirajo v sistemu, ter stopnja njihove difuzije. Objavi Turingove razlage nastanka vzorcev je sledilo mnogo znanstvenih raziskav. Prisotnost modela reakcije in difuzije ter njegovega pomena je bila uspešno dokazana v kemičnih sistemih. Nadaljnje raziskave so se osredotočile na dokazovanje prisotnosti Turingovega mehanizma tvorbe vzorcev v bioloških sistemih. Dokazali so, da je tvorba Turingovih vzorcev pomembna pri obnovi tkiv nekaterih živalih, na primer kuščarjevega repa. Prav tako naj bi bil model reakcije in difuzije eden od mehanizmov tvorbe labirintnih vzorcev v možganski skorji sesalcev, pigmentacije živalske dlake ter oblikovanja prstnih odtisov. Čeprav prisotnost Turingovih vzorcev v razvojni biologiji še ni popolnoma dokazana, lahko v naravi (tudi pri človeku) opazimo mnogo primerov, ki so izrazito podobni Turingovim vzorcem, pridobljenim z matematičnim modeliranjem. V zadnjih letih se znanstveniki intenzivno osredotočajo na tvorbo in dokazovanje Turingovih vzorcev s pomočjo tehnik sintezne biologije. Pridobitev sintezno načrtovanih Turingovih vzorcev bi pomenila velik napredek v sintezni biologiji, saj bi omogočila boljšo razlago tvorbe in nastanka določenih bioloških struktur. Prav tako bi vsa dodatna odkritja omogočila pridobitev znanj in boljše razumevanje delovanja mehanizmov na področju sintetičnega inženirstva tkiv, ki igra pomembno vlogo v razvoju naprednih zdravljenj. Cilj širšega projekta, katerega del je to magistrsko delo, je natančno proučiti in biotehnološko pripraviti Turingovo genetsko vezje, sposobno tvorbe Turingovih vzorcev, ki bi ga bilo mogoče vstaviti v prokariontski organizem E. Coli. Glavni razlog, da raziskave do sedaj v večini niso bile uspešne, je da so genetska vezja zelo občutljiva na vsakršne motnje, doseg pravih in specifičnih parametrov pa je zelo težaven. Scholes in sod. so izvedli temeljito analizo potencialnih genetskih vezij za sintezo Turingovih vzorcev. Rezultati raziskave so vodili do odkritja novih genetskih vezij in njihovih topologij, ki so veliko bolj robustna in manj občutljiva na spremembe parametrov. Genetsko vezje, ki se je izkazalo za najrobustnejše je bilo tri-vozliščno vezje z oznako '3954'. To vezje smo za poglobljeno analizo in optimizacijo izbrali tudi v naši raziskavi. Turingovo genetsko vezje '3954' je sestavljeno iz treh vozlišč, ki so poimenovana s črkami A, B in C. Vozlišči A in B lahko difundirata, vozlišče C pa tega ni sposobno. Vozlišči A in C lahko aktivirata sami sebe, kar dosežemo z genskim inženirstvom pozitivne povratne zanke v njuni regulaciji. Induciranje genetskega vezja '3954', torej začetek njegovega delovanja, omogoča marionetni inducibilni sistem z majhnimi molekulami (angl. marionette small-molecule inducible system). Kot primerni inducibilni majhni molekuli smo izbrali protokatekujsko kislino (PCA) in salicilno kislino (SA). Genetsko vezje za svoje delovanje potrebuje le eno od omenjenih majhnih molekul. Ker so dokazali, da lahko obe molekuli nastaneta v enoencimskih reakcijah znotraj E. Coli, smo vezje '3954' testirali z obema. Omenjeno vezje so v predhodnih raziskavah že vstavili v ogrodje E. Coli, kjer sta PCA in SA predstavljali induktorja vozlišča A. Večina ostalih komponent, kot so promotorji, sintezni encimi, encimi za razgradnjo in transkripcijski dejavniki, so prav tako že predhodno testirali in optimirali za delovanje omenjenega vezja. Glavni cilj magistrskega dela je bila optimizacija vozlišča A s pomočjo načrtovanja različnih plazmidov, ki nosijo zapis za to vozlišče. Nove plazmide, ki smo jih pridobili s pomočjo molekulskega kloniranja, smo testirali in preverili, ali delujejo v skladu z našimi pričakovanji. Delovanje različnih plazmidov smo preverili z merjenjem absorbance fluorescentnih proteinov: vozlišče B nosi zapis za zeleni fluorescentni protein, vozlišče C pa za rdeči fluorescentni protein. S kombinacijo in prilagajanjem specifičnih komponent vseh treh vozlišč smo preverili, kako dodatek različnih zunanjih stimulacij deluje na vozlišče A. Za lažje vrednotenje celotnega vezja smo želeli v vozlišče A vgraditi modri fluorescentni protein. Ugotovili smo, da BFP (blue fluerescent protein) ni primeren za vgraditev v vozlišče A, saj smo zaradi visokega signala ozadnja dobili slabo korelacijo med količino izraženega BFP in aktivnostjo vozlišča A. Pomembno je zavedanje, da je avtoaktivacija oziroma pozitivna povratna zanka vozlišča A nujna za delovanje končnega genetskega vezja – če ne deluje, se to ne more aktivirati in posledično tvorba Turingovih vzorcev ni mogoča. Prav tako smo ugotovili, da pozitivna povratna zanka vozlišča A deluje brez zunanje stimulacije, ko je kot induktor uporabljena PCA. Vsi na novo pridobljeni plazmidi s PCA promotorjem so primerni za vgraditev kot vozlišče A v končno genetsko vezje. Ko smo kot induktor vozlišča A uporabili SA, smo opazili zelo šibko začetno aktivnost pozitivne povratne zanke. Tudi v tem primeru so bili vsi plazmidi delujoči in funkcionalni, a so zahtevali zunanjo stimulacijo vozlišča A s SA. Na pogladi pridobljenih ugotovitev se zdi vozlišče A, ki je zapisano na plazmidih s PCA promotorjem bolj ustrezno za vgraditev v končno genetsko vezje. Ugotovili smo tudi, da s prilagoditvami specifičnih delov DNA, ki se nahajajo pred in po sekvenci, ki kodira zapis za sintezni encim (AroZ/Ybts) lahko vplivamo na količino proizvodnje endogenih induktorjev (PCA in SA). Na podlagi pridobljenih rezultatov lahko trdimo, da vse komponente delujejo pravilno, da je vozlišče A optimirano in primerno za vgraditev v končno genetsko vezje. Sintezno načrtovanje Turingovih vzorcev še vedno predstavlja velik izziv na področju sintezne biologije. Optimizacija vozlišča A in rezultati, ki smo jih pridobili med izdelavo magistrske naloge, predstavljajo korak bližje h končni vgradnji celotnega genetskega vezja v prokariontski E. Coli sistem. Z razvojem sinteznega genetskega vezja za proizvodnjo Turingovih vzorcev, bomo omogočili podrobnejši vpogled v razvojne mehanizme in njihovo razumevanje, to pa bo prineslo napredek na področju biosintetskih terapij, tkivne regeneracije in tkivnega inženirstva. In 1952 Alan Turing published his seminal paper called »The Chemical Basis of Morphogenesis« in which he presents a reaction-diffusion model of biological pattern formation. Based on the interactions of two morphogens, a slowly diffusing activator and a fast diffusing inhibitor, this model enables the formation of spatial patterns which closely resemble those on the leopard spots, zebra stripes, and many other patterns found in nature. Turing patterns have been observed in different chemical systems, whilst their engineering in synthetic biology still presents a big challenge. Synthetic engineering of Turing patterns would present a big step forward in synthetic biology and would provide a better explanation for how patterning occurs in biology. It can also provide practical information for synthetic tissue production, the use of which could contribute to future therapeutic purposes. Previously, different types of genetic circuits capable of Turing patterns production were analysed computationally, and the '3954' Turing circuit proved most promising. This genetic circuit was previously implemented in E. coli chassis with protocatechuic acid (3,4-dihydroxybenxoic acid PCA) and salicylic acid (2-hydroxybenzoic acid SA) as node A diffusers. Most of the circuit components, such as promoters, synthesis enzymes, degradation enzymes and transcription factors, were previously optimised. The focus of this study was node A optimisation, which was performed by creating three different variants of node A, obtained by molecular cloning. These were then tested to verify if node A is functioning as expected. Based on the results obtained in this study, expression levels from node A are believed to be optimized, and all of its components are functioning correctly. |
|---|