| Summary: | La propuesta del presente proyecto se centró en la construcción de enzimas inmovilizadas en forma de agregados enzimáticos entrecruzados (CLEAs) empleando como agentes de entrecruzamiento polímeros multiaminados. Dicho mecanismo de unión se llevó a cabo mediante la formación de enlaces amida a partir de los grupos carboxilo libres de las enzimas y los grupos amino de los agentes de entrecruzamiento empleados. Para ello, los grupos carboxilo fueron previamente activados con la adición de una mezcla 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) para volverse capaces de reaccionar con grupos amino. Como enzima modelo de estudio se seleccionó a la lipasa de Candida rugosa (CRL). En nuestro conocimiento, es la primera vez que se llevó a cabo el entrecruzamiento propuesto para la preparación de CLEAs. El primer paso consistió en la selección de un agente de precipitación. El acetonitrilo fue elegido ya que presentó la mayor capacidad precipitante de la CRL, y además tuvo el menor efecto desnaturalizante. Posteriormente, se estudiaron las variables más importantes que rigen el entrecruzamiento de proteínas mediante el mecanismo propuesto. Dentro de las cuales se encontraron: 1) La concentración de agua presente en el medio de reacción cuando éste es un solvente orgánico, 2) El pH cuando el medio de entrecruzamiento es acuoso, 3) La concentración de EDC-NHS, 4) La adición de albúmina sérica bovina (BSA) como fuente proteica externa, y 5) La adición de trioctanoína como sustrato de bioimprinting para la conservación y protección del sitio catalítico en su forma activa durante el entrecruzamiento (la adición de trioctanoína 0.28 mM permitió recuperar CLEAs con el doble de actividad específica). Además de los CLEAs de la CRL (CRL-CLEAs), se prepararon CLEAs de las lipasas comerciales de Candida antarctica B (CALB) y Thermomyces lanuginosus (TLL). Todos estos biocatalizadores expresaron alrededor del 20-26% de la actividad inmovilizada en forma de CLEAs. La mayor actividad residual en los ...
|
|---|