| Summary: | Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2018. A busca por novos biomarcadores de contaminação aquática levou à identificação, por nosso grupo de pesquisa, de um gene Fatty acid binding protein-like (FABP-like) na ostra Crassostrea gigas. O fato de esse gene ser responsivo a exposição dos animais a esgoto sanitário e ao ibuprofeno chamou atenção para o papel dessa família de proteínas nos moluscos bivalves. As FABPs fazem parte da família das proteínas intracelulares ligantes de lipídeos (iLBPs). Estas são proteínas citoplasmáticas, de estrutura conservada, e capazes de interagir e solubilizar ligantes hidrofóbicos no ambiente aquoso do interior da célula. No entanto, além de ligantes endógenos, as iLBPs são capazes de interagir com várias moléculas lipofílicas exógenas. Recentemente nosso grupo de pesquisa caracterizou a família das iLBPs para a ostra C. gigas (CgiLBPs), identificando 15 genes, 26 transcritos e a ocorrência de eventos de splicing alternativo não sinônimo em três isoformas. Nesse contexto o presente trabalho buscou contribuir para a caracterização funcional destas três isoformas e suas variantes de splicing com base nos seus níveis de transcritos e afinidade por ligantes endógenos e exógeno. Iniciadores específicos para cada variante foram utilizados para quantificar seus níveis de transcritos nos diferentes órgãos da ostra, bem como em animais expostos ao fármaco ibuprofeno, por PCR quantitativa. Análises in silico (atracamento molecular) foram utilizadas para investigar a interação das isoformas com ácidos graxos e ibuprofeno. Por último, duas variantes de uma isoforma foram expressas recombinantemente para investigar, in vitro, suas afinidades por possíveis ligantes, por meio da técnica de dicroísmo circular. Os níveis de transcritos mostraram padrões tecido-específicos, sugerindo que diferentes variantes possuem funções diferentes dependendo do tecido. A alteração nos níveis de transcritos de uma das isoformas após exposição ao ibuprofeno indica que o fármaco pode interferir na função dessas proteínas. A caracterização de possíveis ligantes revelou uma maior afinidade da proteína por ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa, porém com diferenças entre as variantes de splicing. Também observou que duas das isoformas são capazes de ligar ibuprofeno, de maneira muito similar aos ácidos graxos. A expressão de proteínas recombinantes foi realizada com sucesso, produzindo duas proteínas puras e na sua forma nativa. Contudo, análises de dicroísmo circular foram inconclusivas com relação a afinidade das duas proteínas pelos ligantes testados. De maneira geral, os resultados obtidos permitem mostrar que a diversidade gênica e transcricional de iLBPs em C. gigas parece se refletir em uma diversidade funcional, de importância fisiológica e ecotoxicológica a serem melhor estudadas. Abstract : The search for new molecular markers of aquatic contamination has led our research group to the identification of a Fatty Acid Binding Protein (FABP-like) gene in the oyster Crassostrea gigas. Its responsiveness to domestic sewage and ibuprofen has drawn attention to the role of this protein family in bivalve mollusks. FABPs are part of the intracellular lipid binding protein (ILBs) family. These are structurally conserved cytoplasmic proteins responsible to interact and solubilize hydrophobic ligands in the aqueous cell interior. However, besides binding endogenous molecules, iLBPs can also interact with and bind exogenous lipophilic compounds. Recently our research group has characterized the iLBP family in the oyster C. gigas (CgiLBPs). A total of 15 genes and 26 transcripts were found, including three isoforms displaying non-synonymous alternative splicing events. In this context, the present study aimed to characterize functionally these three isoforms, and its splice variants, based on transcript levels and affinity towards endogenous and exogenous ligands. Specific qPCR primers were designed and used to quantify each variant transcripts levels in different tissues and in animals exposed to ibuprofen. In silico analysis (molecular docking) were performed to investigate iLBPs interactions and binding affinity with fatty acids and ibuprofen. At last, two variants of the same isoform were recombinantly expressed and purified in order to evaluate their affinities for possible ligands through circular dichroism. Transcript levels of iLBPs have displayed tissue-specific patterns, possibly indicating tissue-specific functions of different isoforms and their splice variants. Changes in transcript levels, observed in one of the isoforms from animals exposed to ibuprofen, indicates that it might interfere in iLBPs functions. The characterization of CgiLBPs possible ligands revealed that these proteins exhibit higher affinity towards poly-unsaturated long chain fatty acids. It was also observed that two protein isoforms were able to bind ibuprofen similarly to fatty acids. Recombinant expression and purification of two native CgiLBPs was successfully achieved. Although, circular dichroism analysis of ligand binding were inconclusive. Overall, results from this study imply that genomic and transcriptional diversity if iLBPs in C. gigas might reflect some functional diversity as well. In addition, further studies are required to understand physiological and ecotoxicological relevance of this diversification.
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