在嗜鹽古細菌 Haloarcula marismortui 發現一種新型態的感受型光感蛋白質

• Main Authors: 蘇哲瑋, Su, Che-Wei
• Other Authors: 楊啓伸, 臺灣大學:微生物與生化學研究所
• Format: Thesis
• Language: Chinese; English
• Published: 2008
• Subjects: 嗜鹽古細菌;Haloarcula marismorui;光感受器;感受型視紫蛋白質; Haloarchaea;Haloarcula marismortui;photoreceptor;sensory rhodopsin; Arctic
• Online Access: http://ntur.lib.ntu.edu.tw/handle/246246/182442; http://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/182442/1/ntu-97-R95b47213-1.pdf

光感受器 (photoreceptors) 在微生物體內對於感受週遭環境刺激，例如：光，扮演重要的角色，對於微生物生存是必需的。在已知的微生物光感受器中可分為兩類，一為離子幫浦，另一為感受型視紫蛋白質。在 Halobacteria salinarum 中 bacteriorhodopsin (BR) 為離子幫浦的其中一種，負責將細胞內的質子打到細胞外產生質子梯度，進而促使能量的產生。感受型視紫蛋白質主要感受週遭不同波長的光而傳遞驅離或吸引訊號。sensory rhodopsin I (SR I) 和其相對應的觸發器，HtrI，具有調控正趨光及負趨光性的功能。sensory rhodopsin II (SR II) 和其相對應的觸發器，HtrII，只有調控負趨光性的功能。 根據 2004 年完成的 H. marismortui 的基因體計畫，在其基因註解 (annotation) 中，有六個光感受器，是目前所有知道的單一嗜鹽古細菌中最多的。經由表現和特徵吸收峰的測定發現，這六個光感受器分別為三個離子幫浦，兩個感受型視紫蛋白質和一個功能未知的視紫蛋白質。本論文主要著重於這個功能未知，為本實驗室命名但尚未深入研究之光感受器sensory rhodopsin modulator ﹙SRM﹚，及其觸發器，HtrM。 當照射到不同波長的光時，SRM 可藉由本身構形上變化使其在基態和中間激發態﹙即 M state﹚做轉換。利用生物資訊軟體進行分析HtrM，發現它是具有兩個穿膜螺旋區域和胞內出膜延伸之C端結構的細胞質部分，同時它在羧端具有一個 Hamp domain﹙Histidine kinase, Adenylyl cyclases, Methyl-accepting chemotaxis proteins, and Phosphatases domain﹚，這是已知可以和其他蛋白質產生高度交互作用之蛋白質功能區塊。本研究提出SRM之功能假說，認為這個未知功能的蛋白質，是藉由改變基態和激發態之間的比例來調控其光感訊息。 Photoreceptors play important roles in responding to environmental stimuli like light and they are essential for surviving in microbes. Ion pumps and photosensory are two main types of microbial rhodopsin among known microbial photoreceptors. Proton pump, like bacteriorhodopsin 1 in Halobacteria salinarum, pumps out proton to create a proton gradient for eventually energy generation, while photosensory rhodopsins, on the other hand, mediate repellent or attract signal in response to different wavelength of light. Sensory rhodopsin I (SR I) mediates both attract/repellent responses together with its cognate partner protein, HtrI, while sensory rhodopsin II (SRII) is solely responsible for repellent response when working together with its cognate transducer, HtrII.he genome project for Haloarcula marismortui predicted the existence of six photoreceptors, a most abundance and variety among any single archaeon. Overexpression and absorbance measurements of those six photoreceptors concluded them as three ion pumps, two sensory rhodopsins and one unknown type rhodopsin. Here, we propose that this function-unknown protein as a new type of modulatory photoreceptor based on the results that this SRM can switch between ground state and M-intermediate state when exposed to different light wavelength. Also, we cloned and identified the SRM cognate partner transducer, HtrM, which has two trans-membrane region followed by a very short cytoplasmic region containing a HAMP domain in the C-terminus. Finally, we propose SRM modulates photosensory signal for H. marismortui by changing the ratio of Ground/M-intermediate state in response to different wavelength of light. 目錄錄 i目錄 iii文摘要 iv文摘要 v一章 研究背景 1一節 光感受器﹙photoreceptors﹚ 1.1 概論 1.2 微生物中的視紫蛋白質 ﹙microbial rhodopsins﹚ 1.3 感受型視紫蛋白質﹙sensory rhodopsins﹚ 3.4 光週期﹙Photocycle﹚ 5.5 Haloarcula marismortui 6二節 研究現況 7三節 本論文之研究目的 8二章 材料與方法 9一節 實驗材料與藥品 9.1 菌種 9.2 質體 10.3 藥品 10二節 實驗儀器與設備 11.1 核酸電泳設備 11.2 蛋白質電泳與轉印設備 11.3 離心機 11.4 其他 12三節 實驗方法 13.1 選殖 H. marismortui﹙ATCC 43049﹚中光感受器 xop2 與其相關的蛋白質 13.2 於大腸桿菌 E. coli 中表現 H. marismortui 中的光感蛋白質與其相關蛋白質 13.3 重組光感蛋白質與其相關蛋白質純化 13.4 蛋白質分析 15.5 蛋白質檢定 16.6感光測試反應﹙light sensing test﹚ 18.7 SRM 和 HtrM 之間的交互作用實驗 18.8 SRM 的原態表現 19三章 結果與討論 20一節 生物資訊軟體的分析 20.1 胺基酸序列的相似性比對 20.2 GC content 20.3 蛋白質等電點﹙pI﹚的分析 20.4 二級結構的分析 21.5 三級結構分析 23.6 Codon usage analysis 23.7 Hamp domain 的分析 24二節 SRM 的表現 25.1 利用 E. coli 系統表現 SRM 25.2 蛋白質 SDS 膠體電泳及免疫呈色 27三節 SRM 生理功能的鑑定 29.1 SRM 全波長光譜 29.2 光週期的測定 32.3 感光測試反應 ﹙sensing light test﹚ 35.4 SRM 和 HtrM 之間的交互作用 37四節 H. marismortui 全膜蛋白質可見光譜 40.1 SRM 的原態表現 40四章 總結論 42五章 未來展望 43考文獻 44目錄 一 感受型蛋白質會和其觸發器的結合情形。 5 二 藉由 SOSUI 網站預測 H. marismortui 中SRM 的二級結構。 21 三 藉由 SOSUI 網站預測 H. marismortui 中HtrM 的二級結 構。 22 四 利用 SWISS-MODEL 預測 H. marismortui 中 SRM 的三級結 構。 23 五 利用DNAstar網站分析HtrM。 24 六 利用SMART 網站分析HtrM。 24 七 純化不同 E. coli 菌種所表現 SRM 的顏色會有所不同。 26 八 SRM 之SDS 膠體電泳的 CBR 染色圖。 28 九 SRM 之SDS 膠體電泳的免疫呈色圖。 28 十 BL21﹙DE3﹚全波長光譜圖。 29 十一 Arctic﹙DE3﹚全波長光譜圖 30 十二 C43﹙DE3﹚全波長光譜圖。 31 十三 由雷射瞬間激發 SRM 的光週期結果圖。 33 十四 在 pH 7.8 環境下，SRM 黑暗回復光譜圖。 34 十五 在 pH 5.5 環境下，SRM 黑暗回復光譜圖。 34 十六 SRM 感光測試反應光譜圖。 36 十七 在 pH 7.8 且有 HtrM 環境下，SRM 黑暗回復光譜圖。 38 十八 SRM 黑暗回復在有 Htr I 存在時的光譜圖。 38 十九 SRM 在不同的 pH 值下和不同觸發器作用下光週期的改 變。 39 二十 利用 DDM 回溶未經純化 H. marismortui 的全膜蛋白質顏 色 。 40 二十一 H. marismortui 全膜蛋白質可見光譜。 41