| Summary: | Pomimo dużej popularności i znaczenia gospodarczego norki amerykańskiej (Neovison vison Schreb., 1777), jako zwierzęcia futerkowego, oraz skali problemów związanych z jej wsiedlaniem poza zasięgiem naturalnego występowania, badania w zakresie genetyki molekularnej i genomiki tego gatunku są stosunkowo słabo zaawansowane. Jednym z nieprzebadanych dotąd u norki amerykańskiej genów jest gen hormonu wzrostu, którego zróżnicowanie nukleotydowe opisane zostało dla wielu innych gatunków zwierząt. Liczne są również wyniki badań na temat powiązania identyfikowanej zmienności z cechami zwierząt użytkowych istotnymi z gospodarczego punktu widzenia. Celem niniejszej pracy jest poznanie kompletnej sekwencji nukleotydowej, struktury oraz zmienności genetycznej genu hormonu wzrostu norki amerykańskiej (mGH), jak również określenie struktury genetycznej badanej populacji i ocena relacji filogenetycznych N. vison na poziomie taksonów wyższego rzędu na podstawie stwierdzonej zmienności genetycznej. Celem pracy jest również określenie znaczenia biologicznego wykrytego zróżnicowania genetycznego. Badaniom poddano 389 zwierząt (26 norek dzikich z Kanady, 295 norek hodowlanych odmiany brown, scanblack, sapphire, pearl, black cross oraz sapphire cross, 28 zwierząt pozyskanych ze środowiska naturalnego z Polski i 40 z Islandii), których genomowy DNA izolowano z tkanki mięśniowej. W celu poznania struktury i zmienności genu mGH zsekwencjonowano zestaw 3 amplikonów, obejmujących fragment 5'-UTR oraz wszystkie eksony i introny, a na podstawie ustalonych genotypów przeprowadzono szczegółową analizę bioinformatyczną. Wyniki sekwencjonowania ujawniły występowanie 5 eksonów (10 nt, 161 nt, 117 nt, 162 nt, 201 nt) i 3 intronów (245 nt, 171 nt, 176 nt, 290 nt) genu mGH, o łącznej długości 1 745 nt. Zidentyfikowano 14 polimorficznych loci: g.703G>A, g.742G>A, g.748T>C, g.775G>A, g.778G>A, g.846A>G, g.931C>T, g.1156A>G, g.1329T>C, g.616G>C, g.837G>C, g.1219C>G, g.885delC, g.1219_1236delCTCTT GCAGGGGCAGGGG. Ocena ich informatywności i konkluzywności dowodzi, iż najwyższą zdolność do rozróżniania genotypów dla genu mGH charakteryzuje się polimorfizm trójalleliczny g.1219C>G (PIC=0,3039) oraz polimorfizmy dwualleliczne - g.616G>C, g.846A>G i g.931C>T (PIC>0,2400). Wyniki analizy zróżnicowania genetycznego poszczególnych grup badanych dowodzą szczególnie wysokie-go zróżnicowania genetycznego w grupie norek dzikich kanadyjskich oraz odmiany sapphire cross. Stwierdzono również występowanie istotnych odchyleń od stanu równowagi genetycznej Hardy'ego-Weinberg'a, jak również występowanie nierów-nowagi sprzężeń. Wszystkie substytucje zidentyfikowane w obrębie cDNA genu mGH mają charakter milczący, a tym samym nie stwierdzono wpływu zmienności nukleotydowej na zmienność sekwencji aminokwasowej. Ustalono jednocześnie, iż skutki opisywanego zróżnicowania genetycznego związane są z wystąpieniem zmian w obrębie splicing'owych sekwencji regulatorowych i motywów sekwencyjnych, zróżnicowanego odczytywania kodonów oraz wpływają na strukturę drugorzędową mRNA dla genu mGH. Analiza relacji filogenetycznych na poziomie gatunku, jak również na poziomie ponadgatunkowym, dowodzi, iż gen GH jest przydatnym miernikiem procesów mikro- i makroewolucyjnych, determinujących strukturę genetyczną oraz pozycję systematyczną taksonu Neovison vison. Wnioskowanie oparte na zmienności nukleotydowej genu hormonu wzrostu wskazuje, iż wykorzystane w niniejszej pracy zwierzęta pochodzące ze środowiska naturalnego Islandii i Polski są genetycznie bardziej zbliżone do norki hodowlanej, niż do zwierząt dzikich kanadyjskich, co świadczyć może o pochodzeniu ich samych lub ich przodków od zwierząt pochodzących z ferm hodowlanych. Rozpoznane w niniejszej pracy SNP'y wzbogacają tworzoną bazę polimorfizmów jednonukleotydowych norki amerykańskiej, która może być wykorzystana przy konstruowaniu map fizycznych genomu tego gatunku, identyfikacji genów odpowiedzialnych za cechy istotne gospodarczo, do badań z zakresu genomiki porównawczej i funkcjonalnej, czy realizacji programów hodowlanych wspomaganych markerami genetycznymi (MAS). Uzyskane wyniki mogą być wykorzystane również do odróżniania zwierząt utrzymywanych na fermach od zwierząt wolno żyjących oraz mieszańców obu wymienionych form. Ma to szczególnie duże znaczenie w związku z zawlekaniem, wsiedlaniem i naturalizacją gatunku poza jego pierwotnym/naturalnym zasięgiem występowania. Despite the popularity and economic importance of the American mink (Neovison vison Schreb., 1777), as the furbearing animal, as well as the scale of the problems associated with its introduction outside its natural geographical range, research in the field of molecular genetics and genomics of this species are relatively less advanced. One of previously untested genes in the N. vison is growth hormone gene, which nucleotide diversity has been described for many other species. There are also many studies on the relationship between its genetic variability and traits of economic importance in livestock. The aim of this study is to identify a complete nucleotide sequence, structure and genetic variation of the mink growth hormone gene (mGH), as well as to determine the genetic structure of the study population and assessment of N. vison phylogenetic relationships at the highertaxa level on the basis of identified polymorphisms. The aim of this dissertation is also to determine the biological significance of the detected genetic diversity. The study involved 389 animals - 26 Canadian wild minks, 295 animals representing six farm colourbreed (Brown, Scanblack, Sapphire, Pearl, Black-Cross and Sapphire-Cross), 28 feral animals from north-west Poland and 40 from Iceland. The genomic DNA was isolated from muscle tissue. In order to explore the structure and variability of the mGH gene, set of three amplicons, including the 5'-UTR and all exons and introns was sequenced, and on the basis of established gen-otypes detailed bioinformatic analysis was conducted. The results of sequencing revealed the presence of five exons (10 bp, 161 bp, 117 bp, 162 bp, 201 bp) and three introns (245 bp, 171 bp, 176 bp, 290 bp) of the mGH, with a total length of 1 745 bp. 14 polymorphic loci were identified: g.703G>A, g.742G>A, g.748T>C, g.775G>A, g.778G>A, g.846A>G, g.931C>T, g.1156A>G, g.1329T>C, g.616G>C, g.837G>C, g.1219C>G, g.885delC, g.1219_1236del CTCTTGCAGGGGCAGGGG. The assessment of their informativeness and conclusiveness shows that the highest ability to differentiate the mGH gene genotypes has triallelic polymorphism g.1219C>G (PIC = 0.3039), and three diallelic polymorphisms - g.616G>C, g.846A>G and g.931C>T (PIC>0.2400). Results of the analysis of genetic diversity of individual study groups show particularly high genetic diversity among wild minks from Canada and Sapphire-Cross minks. It was also found that there are significant deviations from the Hardy-Weinberg equilibrium. What is more, existence of linkage disequilibrium was identified. All substitutions identified within cDNA of the mGH gene are silent, and thus there was no effect of this gene nucleotide sequence variation on amino acid sequence variation of its protein product. Nevertheless, it was also found that described effects of genetic diversity are associated with the occurrence of changes in the splicing regulatory sequences and sequential motifs, codon usage bias and influence on secondary structure of mRNA for the mGH gene. Analysis of the phylogenetic relationships at the species level, as well as at higher taxa level, shows that the GH gene is a useful measure of micro- and macroevolutionary processes that determine the genetic structure and the systematic position of the Neovison vison taxon. Inference based on nucleotide variation of the growth hormone gene suggests that Icelandic and Polish animals used in the present study are genetically more similar to farm-mink than to wild animals from Canada. That proves the origin of themselves or their ancestors from animals originating from ranchanimals. SNPs reported in this paper enrich single nucleotide polymorphisms database for the American mink, which can be used in the construction of physical maps of this species, identification of genes responsible for traits of economic importance, in comparative and functional genomics research, or the implementation of genetic marker-assisted breeding programs (MAS). The results can be also used to genetic distinguishing animals kept on farms from free-living animals and hybrids of both of these forms. This is particularly important in connection with introduction and naturalization of the species outside its original/natural range.
|
|---|