The lipases from Candida antarctica : cloning, expression and their application in the synthesis of structured lipids : Die Lipasen aus Candida antarctica : Klonierung, Expression und ihre Anwendung in der Synthese von strukturierten Lipiden

• Main Author: Pfeffer, Jan Christoph
• Format: Article in Journal/Newspaper
• Language: English
• Published: Universität Stuttgart 2008
• Subjects: Lipide , Klonierung , Heterologe Genexpression; 570; structured lipids , lipase , expression , cloning , Candida antarctica; Antarc*; Antarctica
• Online Access: https://dx.doi.org/10.18419/opus-901; http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/918

This work was part of the cooperation "Sturctured Lipids by Bio-Engineering" between the Institute of Technical Biochemistry at the University of Stuttgart and the Nestlé Research Center in Lausanne, Switzerland. In the framework of this project new enzymatic methods for the synthesis of structured triacylglycerides and 2-monoacylglycerides were established and scaled up to a technical scale (> 100 gram product). Additionally a lipase showing high sn2-preference which is an ideal prerequisite for the direct synthesis of 2-monoacylglycerides and structured lipids was expressed in technical scale (5 litre fermenter), purified and generally characterised. For this lipase the prerequisites for an error-prone PCR (epPCR)-based mutagenesis aiming at improvement of the biocatalyst were generated. The chemical synthesis of 2-monoacylglycerides is challenging due to several reaction steps, a costly purification and often results in very low yields. In contrast 2-monoacylglycerides and structured triacylgylcerides are relatively easy to synthesise using lipases with regard to yield and purity. Lipase A from Candida antarctica seemed to be a promising catalyst for the direct esterification of fatty acids and glycerol yielding in 2-monoacylglycerides. This enzyme displays the highest preference for the sn2-position published in scientific literature. The immobilised enzyme showed only a very weak esterification potential and the esterification was - in contrast to the hydrolysis, where CalA showed a clear sn2-preference - unspecific. Different parameters (temperature, solvent, water activity, substrates of different chain lengths, and use of ionic liquids) were changed, but no improvement in activity or specificity could be observed. Therefore optimisation of CalA via directed evolution was planned. As the crystal structure of CalA is not solved yet and also the homology with other lipases is quite low, the only possibility to optimize the enzyme was directed evolution: design of a mutant library by epPCR followed by a high-throughput-screening using a versatile assay system. As the functional expression of CalA in a fast-growing and easy-to-handle-microorganism is a major prerequisite for directed evolution, the expression of the lipase had to be adapted to E. coli. With pUC18 - a standard vector for E. coli - no active protein was expressed. Therefore special expression vectors of the pET- and pCold-series were chosen and the protein folding was supported by co-expression of special folding proteins - so-called chaperones. The combination of the pColdIII-plasmid and the Gro7-chaperone showed best results for hydrolysis activity of CalA yielding in an specific activity of 13.1 U/mg of total soluble protein. Consequently the major bottleneck for directed evolution of CalA was overcome and a following directed evolution generated new mutants of CalA showing an increased sn2-preference. Especially a quadruple mutant showed an increased sn2-prefernce for hydrolysis reactions. In parallel to the CalA-approach, a new process for the synthesis of 2-mono- (2-MAG) and structured triacylgylcerides (TAG) allowing the application of wild-type enzymes was established. However in this process two steps for the synthesis of 2-MAG are necessary. The first reaction step is an esterification of glycerol and free fatty acids catalysed by an unspecific lipase. The product of this first reaction is a homogeneous TAG which is in the second reaction - an alcoholysis reaction - converted to a 2-MAG catalysed by an sn1,3-specific lipase. In a possible third reaction step the outer positions of the glycerol backbone can be blocked with a short- or medium-chain fatty acid to avoid acyl migration of the fatty acid from the sn2 position to an outer position. As the project was mainly focused on the synthesis of 2-MAG of polyunsaturated fatty acids (PUFA), the lipases catalysing the process had to be able to convert such bulky fatty acids. A screening of different lipases showed that the whole process can be catalysed by just one lipase: the lipase B from Candida antarctica (CalB). This enzyme shows an unspecific manner in the esterification reaction, but converts the TAG sn1,3-specifically in an ethanolysis reaction. So by the use of just one biocatalyst two totally different reactions can be performed with different specificity. After the reactions were performed successfully and with high yields, the process was up-scaled in the miniplant of the Institute of Biochemical Engineering (IBVT). In this scale tripalmitin was converted in a two-step process - alcoholysis to the corresponding 2-MAG followed by esterification with oleic acid - to 1,3-Dioleoyl-2-palmitoylglycerol (OPO), which is a major component of mother milk. : Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen der Kooperation "Structured Lipids by Bio-Engineering" zwischen dem Institut für Technische Biochemie an der Universität Stuttgart und dem Nestlé Research Center in Lausanne durchgeführt. Im Rahmen des Projekts wurden neue Möglichkeiten zur enzymatischen Synthese von Lipiden definierter Zusammensetzung und Struktur (strukturierte Lipide) sowie 2-Monoacylglyceriden entwickelt und die Synthese auf einen technischen Produktionsmaßstab (> 100 g) gebracht. Darüber hinaus wurde eine für die Synthese von strukturierten Lipiden viel versprechende Lipase im technischen Maßstab (5 l Fermenter) exprimiert, aufgereinigt und charakterisiert sowie die Grundlagen für eine gerichtete Evolution zur Optimierung des Biokatalysators geschaffen. Die chemische Synthese von 2-Monoacylglyceriden benötigt mehrere Reaktionsstufen, eine sehr aufwändige Aufreinigung und hat mit relativ geringen Ausbeuten zu kämpfen. Dagegen sind 2-Monoacylglyceride und strukturierte Triacylglyceride unter dem Einsatz von Lipasen relativ leicht in hohen Ausbeuten und geringem technischen Einsatz herstellbar. Als viel versprechendes Enzym zur direkten Synthese von 2-Monoglyceriden schien sich die Lipase A aus Candida antarctica (CalA) zu erweisen. Dieses Enzym besitzt die seltene Eigenschaft einer Präferenz für die Position sn2 des Glycerinrückgrats (sn2-Päferenz), und unter den bereits beschriebene Enzymen mit dieser Eigenschaft weißt sie die höchste Präferenz für dieses Position auf. Die exprimierte und immoblisierte CalA zeigte nur eine sehr geringe Aktivität in Veresterungsreaktionen und die Veresterungsreaktion verlief - im Gegensatz zur Hydrolyse, in der CalA eine sn2-Präferenz aufwies - unspezifisch. Da auch verschiedene Parametereinstellungen keine Verbesserung der Reaktivität und der Spezifität brachten, wurde eine Optimierung des Enzyms durch gerichtete Evolution ins Auge gefasst. Da eine Expression von CalA in einem schnell wachsenden und leicht kultivierbaren Mikroorganismus wie E. coli eine Voraussetzung für die gerichtete Evolution ist, musste die Expression der Lipase in E. coli optimiert werden. Da mit dem Standardvektor pUC18 kein aktives Protein hergestellt werden konnte, wurde auf spezielle Expressionsplasmide der pET und pCold-Reihe zurückgegriffen und die Faltung durch Co-Expression verschiedener Faltungshelfer - sogenannter Chaperone - unterstützt. Die Kombination des pColdIII-Plasmides und des Gro7-Chaperones zeigten hierbei die besten Ergebnisse und CalA wies dabei eine spezifische Aktivität von 13,1 U/mg im löslichen Gesamtprotein auf. Damit war die größte Hürde für eine gerichtete Evolution von CalA überwunden mittels gerichteter Evolution konnten Mutanten von CalA mit erhöhter sn2-Präferenz hergestellt werden. Dabei zeigte besonders eine vierfach Mutante eine um 10 % erhöhte Präferenz für die sn2-Position in Hydrolyse-Reaktionen. Parallel zu dem CalA-Ansatz wurde ein Verfahren zur Synthese von 2-Mono- und strukturierten Triacylglyceriden entwickelt, welches den Einsatz von Wildtyplipasen erlaubt. Bei diesem Verfahren sind allerdings zur Synthese von 2-Monoacylglyceriden zwei Schritte notwendig. Die erste Reaktion ist eine Veresterung von Glycerin und freien Fettsäuren, die von einer unspezifischen Lipase katalysiert wird. Am Ende der ersten Reaktion erhält man ein homogenes Triacylglycerid, welches in einer Alkoholyse mit einer sn1,3-spezifischen Lipase umgesetzt wird und das 2-Monoacylglycerid bildet. Da vor allem die Synthese von 2-Monoacylglyceriden von mehrfach ungesättigten, langkettigen Fettsäuren vorgesehen war, mussten Lipasen gefunden werden, die ein räumlich geeignetes aktives Zentrum aufweisen, um die Substrate umzusetzen. Ein Screening verschiedener Lipasen zeigte, dass der gesamte zweistufige Prozess zur Synthese von 2-Monoacylglyceriden unter dem Einsatz einer einzigen Lipase möglich war: der Lipase B aus Candida antarctica (CalB). Dieses Enzym zeigt einerseits in der Veresterungsreaktion ein unspezifisches Verhalten, so dass ein homogenes Triacylglycerid entsteht und andererseits ändert sich in der Alkoholyse durch den Ethanolgehalt des Lösungsmittelgemisches seine Spezifität und die Lipase spaltet das Triacylglycerid sn1,3-spezifisch. Nachdem die Reaktionen erfolgreich und mit hohen Ausbeuten durchgeführt werden konnten, wurde der Maßstab des Prozesses auf eine vorindustrielle Produktionsstufe vergrößert. Dies wurde in der Miniplant des Instituts für Bioverfahrenstechnik durchgeführt. Dort konnte in einer zweistufigen Reaktion aus Tripalmitin - durch Alkoholyse mit anschließender Veresterung mit Ölsäure - der Muttermilchersatz 1,3-Dioleoyl-2-palmitoylglycerol (OPO) hergestellt und damit der 2-Stufen-Prozeß erfolgreich vom Labor- in den Technikumsmaßstab übertragen werden.