Enzymes for industrial acrylation : redesign of candida antarctica lipase B and characterization of a new cutinase from alternaria brassicicola : Enzyme für die industrielle Acrylierung : neues Design der Candida antarctica Lipase B und Charakterisierung einer neuen Cutinase aus Alternaria brassicicola

• Main Author: Liu, Danni
• Format: Article in Journal/Newspaper
• Language: English
• Published: Universität Stuttgart 2009
• Subjects: Lipasen , Cutinase , Proteindesign , Heterologe Genexpression , Pichia pastoris , Candida antarctica; 570; Acrylierung , Immobilisierung , Charakterisierung; acrylation , immobilization , characterization; Boden; Antarc*; Antarctica
• Online Access: https://dx.doi.org/10.18419/opus-1207; http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/1224

Candida antarctica lipase B (CALB) (EC 3.1.1.3) is a serine hydrolase with an alpha/beta hydrolase fold. BASF have screened some well-known enzymes for transesterification of hydroxypropylcarbamate (hpc: 1hpc, 2hpc, 3hpc and 4hpc) with methyl acrylate. The results showed that the CALB had the highest activity among all the screened enzymes. However, the wild-type CALB does not catalyze full conversion in an acceptable time scale. For industrial purposes it was necessary to increase the activity of the wild-type enzyme. The S-enantiomer of the secondary alcohol was identified as the bottleneck for reaching full conversion. In order to improve the acrylation, the stereospecificity pocket was redesigned using predictions from molecular modeling. Positions 278, 104 and 47 were targeted and a library for two-site saturation mutagenesis at positions 104 and 278 was constructed. For library screening, CALB variants were expressed in Escherichia coli (E. coli). This expression system is more suitable for high-throughput requirements in terms of expression time and number of clones. However, Pichia pastoris (P. pastoris) X-33 was selected as an ideal expression host of CALB for the higher expression level of the recombinant gene. After expression in P. pastoris, CALB variants were characterized with respect to activity in tributyrin hydrolysis, hydroxypropylcarbamates acrylate (hpca) hydrolysis and stereoselectivity in hydrolysis of 1-phenylethyl propionate. With respect of acrylation of hpc with methyl acrylate, lyophilized and immobilized CALB were used as an almost water-free reaction system since the presence of water in reaction can disturb the conversion. Apart from the identification of appropriate mutants, a suitable carrier for the enzyme also plays an important role in the reaction. It was shown that CALB showed only activity towards the substrate after immobilization on hydrophobic carriers, e.g. on Accurel MP1000. Therefore, hydrophobic carriers Accurel MP1000 and Diaion HP20L were prepared for the following transesterification studies. The best mutants L278A, L278A/W104F, L278A/W104F/S47A showed an increased activity in hydrolysis and transesterification of more than 30%. While the wild-type showed only 73% conversion after 6 hours in the target reaction, 95% conversion was achieved by the mutant L278A. Besides this reaction general hydrolysis activity (tributyrin) of the new CALB variants was increased up to 8-fold, while stereoselectivity decreased by a factor of 75 in hydrolysis of 1-phenylethyl propionate. Thus the new biocatalysts can be used for efficient transformation of a wide range of racemic alcohols and esters. Cutinase (EC 3.1.1.74) is a serine hydrolase with an alpha/beta hydrolase fold and can catalyze the hydrolysis of cutin. A patented cutinase from Humicola insolens (H. insolens) (Hi_Cutinase) showed high activity for the transesterification of methyl acrylate and amino- or mercaptoalcohol. For economical industrial applications, our aim was to find a cutinase, which shows homology to the Hi_Cutinase and exhibits also activity for the acrylation of methyl acrylate with amino- or mercaptoalcohol, which was 6-mercaptohexanol in our work. From analysis of the alignment of cutinases and the deduced 3D conformational models, a cutinase (pCUTAB1) from A. brassicicola showed homology to the proprietary cutinase from Humicola insolens (Hi_cutinase) with a sequence identity of 61%. As far as we know, this is the first time that the cutinase pCUTAB1 was cloned into the pPICZaA and integrated into the genome of the methylotrophic yeast P. pastoris X-33. The cutinase was expressed and secreted using alpha-factor signal peptide from Saccharomyces cerevisiae under control of the methanol inducible promoter of the alcohol oxidase 1 gene (AOX1). After expression at flask level, the supernatant was concentrated by ultrafiltration with a 10 kDa cut off membrane and purified to apparent homogeneity with hydrophobic interaction chromatography in a single step under native conditions using HiTrap™ Phenyl FF. The purified recombinant pCUTAB1 showed both the glycosylated and the unglycosylated forms, with distinct molecular weight of 24 kDa and 20 kDa respectively. The latter one corresponds to the mass of the mature protein without of the potential signal peptide of pCUTAB1. The cutinase prefers relatively bulky glycerol esters to single chain aliphatic esters, and showed the highest activity towards tributyrin. The optimum temperature and pH of the recombinant pCUTAB1 was 40°C, and pH 7-10 respectively. For acrylation of 6-mercaptohexanol, the cutinase immobilized on Accurel MP1000 showed higher activity than the immobilized lipase CALB. 90% conversion after 3 h was reached using the cutinase pCUTAB1, while the lipase CALB reached this level of conversion only after 7 h. : Candida antarctica Lipase B (CALB) (EC 3.1.1.3) ist eine Serin-Hydrolase mit einer Alpha/Beta-Hydrolasefaltung. Beim von der BASF durchgeführten Screening von bekannten Enzymen für die Acrylierung von Methylacrylat und Hydroxypropylcarbamaten (Hpc), einer Mischung aus R- und S-Enantiomeren von primären und sekundären Alkoholen, zeigte CALB die höchste Aktivität. Jedoch kann der CALB Wildtyp (WT) einen vollständigen Umsatz in annehmbarer Zeit nicht erreichen. Es wurde gerichtete Evolution und rationales Proteindesign durchgeführt, um eine Mutante von CALB zu erhalten, die sowohl eine hohe Aktivität gegen die Edukte (Hpc) also auch eine geringere Enantioselektivität zeigt, und um einen vollständigen Umsatz zu erreichen. Jedoch in der durch Error-Prone PCR erstellten Bibliothek war die Mutageneserate zu hoch und damit die Anzahl der Kolonien mit aktiver Lipase zu niedrig. Für das rationale Proteindesign wurde das S-Enantiomer des sekundären Alkohols (2Hpc) als Hindernis für das Erreichen des vollständigen Umsatzes identifiziert. Die mit Hilfe der MD-Simulationen identifizierte Mutante L278A zeigte einen verkürzten Abstand von 2hpca zum katalytischen His. Deshalb wurde an den Positionen 277, 278 und 281, die den Eingang in das aktive Zentrum formen, eine Sättigungsmutagenese durchgeführt und die resultierende Bibliothek gescreent. Für das Screening der Bibliothek wurden die CALB-Varianten in E. coli exprimiert und ein Hpca-Assay entwickelt. Bei dem Screening der o.g. Bibliothek zeigte die Mutante L278A die höchste Aktivität in der Hydrolyse von Tributyrin und Hpca. In der Literatur wurde die Vergrößerung der Stereoselektivitätstasche für das S-Enantiomer des sekundären Alkohols durch die Mutation an Position W104 berichtet, die den Boden der Stereoselektivitätstasche bildet. Zur Erweiterung der Stereoselektivitätstasche für das S-Enantiomer und Erhöhung der Aktivität von CALB, wurde eine Zweifachsättigungsmutagenese-Bibliothek an Positionen L278 und W104 hergestellt. Die Mutanten L278A und L278A/W104F aus dem Screening zeigten eine höhere Aktivität gegen die Hydrolyse von Tributyrin und Hpca als der WT. Darüber hinaus wurde die Position S47, die die Stereoselektivitätstasche auch bildet, als zusätzliche Mutation zur Erweiterung der Stereoselektivitätstasche ausgewählt. Deshalb wurden die Mutanten L278A (A), W104F (F), L278A/W104F (AF), L278A/S47A (AA), L278A/W104F/S47A (AFA) erstellt, in P. pastoris exprimiert und im Hinblick auf die Aktivität bei der Hydrolyse von Tributyrin sowie Hpca und die Stereoselektivität in der Hydrolyse von 1-Phenylethylpropionat charakterisiert. L278A zeigte die höchste spezifische Aktivität gegen Tributyrin. Darüber hinaus zeigten die Mutanten A, AF, AA, AFA höhere Aktivitäten gegen die Hydrolyse von Hpca als der WT. Insbesondere wurde die Enantioselektivität von der Mutanten AF und AFA stark reduziert, von über 300 auf 4 beziehungsweise 5. Die lyophilisierte CALB zeigte keine Aktivität in der Acrylierung von Hpc in organischen Lösungsmitteln. Daher wurden der WT und die Mutanten A, AF und AFA, welche alle eine höhere Aktivität als der WT gegen Hpca aufwiesen, auf zwei hydrophoben Trägern (Accurel MP1000, Diaion HP20L) immobilisiert. Mit den immobilisierten Lipasen wurde die Aktivität bei der Acrylierung von Hpc verglichen. Es lässt sich feststellen, dass unter Verwendung von den Mutanten auf MP1000 nach 24 Stunden und auf HP20L nach 29 Stunden Hpc zu 90% umgesetzt werden konnte, während dies beim WT erst nach 48 Stunden unabhängig vom verwendeten Trägermaterial gelang. Cutinase ist eine Serin-Hydrolase mit einer Alpha/Beta-Hydrolasefaltung und katalysiert die Hydrolyse von Kutin. Eine Cutinase aus Humicola insolens (Hi_cutinase), zeigte die höchste Aktivität für die Acrylierung von Methylacrylat mit Amino- oder Mercapto-Alkoholen aus einem Screening einer Enzymbibliothek von BASF. Aber diese Cutinase wurde schon patentiert. Deshalb war das Ziel, ein Enzym zu finden, das neben der Homologie zur Hi_cutinase auch die Acrylierung von Amino- oder Mercapto-Alkoholen katalysiert. Bei der Analyse der Sequenz verschiedener Cutinasen zeigte eine Cutinase pCUTAB1 aus Alternaria brassicicola eine Sequenzidentität von 61% zur Hi_cutinase. Das Gen (CUTAB1) wurde in P. pastoris funktionell exprimiert. pCUTAB1 wurde aufkonzentriet und über eine hydrophobe Säule aufgereinigt. Das Enzym wurde teilweise glykolysiert und zeigt dann eine Molekulare Masse von 24 kDa und 20 kDa im SDS-Gel. Für die Messung von Substratoptimum wurden Ester mit verschiedener Kettenlänge des Acylrestes als Substrat genommen. Die höchste spezifische Aktivität wurde gegen Tributyrin beobachtet. Das Temperaturoptimum von pCUTAB1 lag bei etwa 40°C und das pH-Optimum bei etwa 7-10. Bei der Acrylierung von 6-Mercaptohexanol mit der Lipase CALB und der Cutinase, zeigte die Cutinase einen Umsatz von 90% nach 3 Stunden, während CALB diesen erst nach 7 Stunden erreichte.