鲆鲽类精原干细胞体外培养及其增殖、分化调控机制和不育受体制备研究
生殖细胞移植（ Germ cell transplantation ， GCT ）是一项将供体生殖干细胞移植到不育受体中，从而使受体产生供体后代的技术，在保护濒危鱼类、种质遗传改良等方面具有广阔的应用前景，越来越受到研究者的重视。然而，在经济鱼类 G CT 研究中，难以获得高纯度的供体生殖干细胞，以及对外源干细胞在受体内增殖、分化及发育的基础认知不足等问题常常导致移植效率低甚至移植失败。 大菱鲆（ Scophthalmus maximus ）和牙鲆（ Paralichthys olivaceus ）同属鲽形目，都是我国沿海重要的海洋经济养殖鱼种。本研究以大菱鲆和牙鲆为研究对象，探索了大菱鲆精原...
| Main Author: | |
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| Other Authors: | |
| Format: | Other/Unknown Material |
| Language: | Chinese |
| Published: |
2024
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| Subjects: | |
| Online Access: | http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/185248 |
| Summary: | 生殖细胞移植（ Germ cell transplantation ， GCT ）是一项将供体生殖干细胞移植到不育受体中，从而使受体产生供体后代的技术，在保护濒危鱼类、种质遗传改良等方面具有广阔的应用前景，越来越受到研究者的重视。然而，在经济鱼类 G CT 研究中，难以获得高纯度的供体生殖干细胞，以及对外源干细胞在受体内增殖、分化及发育的基础认知不足等问题常常导致移植效率低甚至移植失败。 大菱鲆（ Scophthalmus maximus ）和牙鲆（ Paralichthys olivaceus ）同属鲽形目，都是我国沿海重要的海洋经济养殖鱼种。本研究以大菱鲆和牙鲆为研究对象，探索了大菱鲆精原干细胞（ S permatogonial stem cell ， S SC ）的体外培养条件，并通过单细胞测序（ Single cell RNA-seq ， scRNA-seq ）对大菱鲆精巢内调控 S SC 自我更新和分化的重要信号通路和潜在的分子标记开展了系统分析。同时还研究了白消安对牙鲆精巢生殖细胞的消除作用，并确定了使用白消安制备成年牙鲆不育受体的最佳条件。研究结果如下： 1. 大菱鲆 S SC 体外培养 将 percoll 密度梯度离心纯化后的大菱鲆 S SC 接种到基础培养基、 FSH 培养基、 GDNF 培养基和 FSH&GDNF 培养基中培养一周，发现只有添加 GDNF 的后两种培养基能保留更多的 S SC 。实时荧光定量的结果进一步证明 GDNF 存在时培养基中的细胞 v asa 表达量高于其他培养基。同时， FSH 和 GDNF 还能促进体细胞更快地增殖。 将经过纯化的大菱鲆 S SC 接种到基础培养基和鱼血清培养基后，通过 VASA/ EdU 免疫荧光染色发现第 42 天时两种培养基中均检测到双阳性的细胞，说明此时生殖细胞仍在增殖。然而，基础培养基无法维持 S SC 长期存活，鱼血清培养基中生殖细胞则可持续存活超 5 个月，但数量极少，仅能通过 VASA 抗体免疫荧光染色证明其存在 。 2. scRNA-seq 分析揭示大菱鲆 S SC 自我更新与分化的关键调控网络和各时期生殖细胞基因表达特征 通过 scRNA-seq 对大菱鲆幼鱼精巢中 15469 个细胞进行分析，鉴定出 9 个体细胞群和 1 个生殖细胞群。通过 CellChat 分析了不同细胞群之间的细胞通讯作用，共富集到 17 条信号通路。结果显示 GDNF 通路在大菱鲆精巢内具有自分泌和旁分泌作用途径，负责调控 S SC 自我更新； RA 通路和 FGF 信号通路都与 SSC 分化相关，而且 R A 通路内关键基因的表达情况比哺乳动物更加复杂，不仅具有多种体细胞来源，还具有生殖细胞表达。 P TN 通路则主要控制精原细胞分化，同样具有自分泌途径。对生殖细胞群细分显示，该类群细胞可进一步分为 2 个 S SC 细胞群、 3 个不同发育时期的精原细胞群和 1 个精母细胞群，并通过拟时序分析揭示了不同发育状态 SPG 的分化轨迹和基因转录表达动态特征。此外，还发现 n anos2 、 gfrα1 和 i d4 等基因标记 S SC 的功能在哺乳动物和大菱鲆上是保守的，首次发现 dnmt3bb.1 和 g rb7 为 大菱鲆 S SC 的标记基因。 3. 白消安制备成年牙鲆不育受体 设置四个白消安浓度，包括 40mg/kg 、 60mg/kg 、 80mg/kg 和 120mg/kg ，对即将进入繁殖期的成年雄性牙鲆进行腹腔注射。组织学的结果显示，不经注射的对照组牙鲆进入繁殖盛期，精巢中充满精子，而同时期注射过白消安的各实验组牙鲆精巢显示出不同程度的退化，其中 60mg/kg 实验组牙鲆精巢体积明显缩小，精巢内小叶腔消失，无精子残留，只有精原细胞存在，说明该浓度对繁殖期成年雄性牙鲆精巢生殖细胞具有最好的消除效果。 VASA 抗体免疫荧光染色和实时荧光定量结果显示 60mg/kg 处理的牙鲆精巢中精原细胞最多， v asa 表达量最高，证明该浓度处理得到的牙鲆精巢适宜精原细胞存活，能够作为 G CT 的不育受体。 Germ cell transplantation (GCT)involves transplanting germline stem cells from donors into sterile recipients, enabling the recipients to produce offsprings with the donor's genetic characteristics. This technology holds significant promise for conserving endangered fish species and genetic improvement of germplasm. ... |
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