大菱鲆密度胁迫信息素鉴定及信号传导调控通路研究

• Main Author: 李纪元
• Other Authors: 李军
• Format: Other/Unknown Material
• Language: Chinese
• Published: 2024
• Subjects: 大菱鲆，密度胁迫，信息素，嗅觉感知，调控通路; 理学; 理学::海洋科学; Scophthalmus maximus
• Online Access: http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/185180

高密度养殖可以降低养殖占地需求，增加单位面积产量，实现更高的经济效益，因此成为水产养殖领域的共同诉求。然而，养殖密度过高会产生胁迫作用，直接影 响鱼类的生长与存活。在此过程中，鱼类如何感知密度胁迫从而导致生长受限乃至死亡，原因尚不明确。鱼类应激皆是建立在对胁迫因子感知的基础上，因此，高密度养殖环境中胁迫因子的鉴别成为解析密度胁迫机制的关键。 信息素作为化学信号传递介质，在鱼类繁殖、生长甚至生存等方面具有重要作用 。但是，高密度养殖下的化学通讯在很大程度上被忽略。 因此，本研究以大菱鲆（ Scophthalmus maximus ）为研究对象，将信息素作为切入点，通过环境代谢组学、转录组学、基因克隆、 ELISA 分析等方法筛选大菱鲆密度胁迫潜在信息素，鉴定信息素嗅觉感知受体；探究信息素介导的密度胁迫产生的具体机制，为集约化健康养殖技术的建立提供参考依据。 （ 1 ）大菱鲆密度胁迫信息素筛选 本研究设置低密度（ LD ）、中密度（ MD ）和高密度（ HD ） 3 个处理组， 利用 不同密度处理下大菱鲆 HPI 轴、 GH/IGF-1 信号通路 生理响应情况以确定胁迫状态，同时 利用高通量非靶向代谢组学技术，筛选不同密度下大菱鲆释放到水环境中 的差异 代谢物。结果表明：苯乙烯、脯氨酸、黄嘌呤、十六烷基二酸和苯乙胺 为 MD vs. LD 、 HD vs. MD 和 HD vs. LD 共有的 显著上调 差异代谢物（ p <0.05 ） 。 根据化合物功能分析，苯 乙胺 被作为首要候选密度胁迫信息素 。苯乙胺合成关键基因 aadc 组织分布表达显示：肝脏中 aadc 表达显著高出其它组织 6 倍以上（ p <0.05 ） ， 说明肝脏是苯乙胺主要合成部位。同时，苯乙胺肝脏合成 不受 密度处理的影响 ， 能持续稳定合成。 苯乙胺符合 密度胁迫 信息素 的基本条件，其浓度 与养殖密度紧密相关。 （ 2 ） 大菱鲆苯乙胺嗅觉受体鉴定 克隆获得大菱鲆 taar4 基因 ORF 序列，大菱鲆 taar4 的 ORF 长度为 984bp ，编码 327 个氨基酸。该蛋白拥有 7 个 α 螺旋跨膜结构域，为疏水性稳定蛋白 ， 且 符合经典的物种进化理论。 利用双萤光素酶报告基因实验，将转染的细胞与不同浓度的苯乙胺（ 0 （ CON ） 、 10 -12 、 10 -9 、 10 -6 、 10 -3 mol/L ）共同孵育激活大菱鲆 TAAR4 受体。结果表明：当苯乙胺浓度达到 10 -9 mol/L 时，荧光素酶活性与 CON 差异 显著 （ p <0.05 ） ； 随着苯乙胺浓度 （ 10 -6 、 10 -3 mol/L ） 的升高，荧光素酶活性呈上升趋势 ， 差异极显著（ p <0.001 ），证明 苯乙胺 与 大菱鲆 TAAR4 互为配 - 受体 ， TAAR4 与 苯乙胺 结合反应 具有剂量依赖性和痕量效应特 点 。 （ 3 ）苯乙胺介导大菱鲆胁迫应答信号通路研究 本研究 设置苯乙胺外源添加急性处理实验，将水环境苯乙胺浓度设定为 0 （ CON ）、 10 − 7 （ LP ）和 10 − 5 （ HP ） mol/L ，暴露大菱鲆 于 此环境中 2d 。 结果显示 ：苯乙胺处理组和密度处理组 HPI 轴（ crh 、 acth ）、 GH/IGF-1 信号通路（ gh 、 igf-1 ）关键基因表达特征和 血液 生化指标变化规律（葡萄糖、皮质醇、甘油三酯、 T 3 ）具有高度相似性 ， 外源性添加苯乙胺同样 对大菱鲆产生负面影响。大菱鲆 苯乙胺梯度处理 与 养殖 密度 梯度处理 应激生理响应 规律高度 一致。 肝脏 转录组数据分析显示： 大菱鲆感知苯乙胺 前后差异表达基因显著富集 在 糖酵解过程（ glycolytic process ）、 HIF-1 信号通路（ HIF-1 signaling pathway ）、 内质网蛋白质加工（ p rotein processing in endoplasmic reticulum ） 、 凋亡过程（ a poptotic process ）等信号通路上 。 血液生理生化 指标 验证 显示：暴露于苯乙胺环境中导致大菱鲆血液 Hb 含量 显著 下降， MetHb 含量 显著 上升 ， ALT 、 AKP 、 LDH 的 活性 显著高于 CON 组 （ p <0.05 ） ， 说明 苯乙胺 处理 后大菱鲆 血液携氧能力 可能 下降 使 机体缺氧 ，从而激活肝脏低氧诱导通路。 一方面 导致 机体能量代谢改变，无氧糖酵解和脂质代谢增加，脂肪积累减少，另一方面，肝脏内质网应激，激活 UPR 反应清理错误折叠蛋白质，消耗大量 ATP ， 可能 进一步减少用于生长的能量。此外，过度的内质网应激激活了大菱鲆内源性凋亡途径 ，导致肝细胞损伤 。 ...