大菱鲆早期发育过程中蛋白酶起源及发生过程的研究

• Main Author: 迟良
• Other Authors: 李军
• Format: Other/Unknown Material
• Language: Chinese
• Published: 2013
• Subjects: 大菱鲆; 胃蛋白酶; 胃质子泵; 胰蛋白酶; 早期发育; Scophthalmus maximus
• Online Access: http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/17695

消化酶是由消化腺和消化系统分泌的具有消化功能的酶类。消化酶对鱼类的生长发育及新陈代谢过程都起到重要的作用。由于海水鱼类的主要营养来源是蛋白质，因此蛋白酶是鱼类中最主要的消化酶类，其中胃蛋白酶和胰蛋白酶是最重要的两种蛋白消化酶。鱼类早期发育过程中，消化器官的发育及其功能化的过程对于鱼类的生产实践具有重要的指导作用，而蛋白酶的出现也是消化器官功能形成的一个重要的标志，因此，研究蛋白酶的起源发生过程对于了解鱼类的消化过程及消化机制的理论研究有重要意义。 大菱鲆(Scophthalmus maximus)属于鲽形目、鲆科，分布于大西洋北岸，自上世纪90年代引进我国，由于其生长迅速、抗病能力强，营养丰富等特点，目前已是我国重要的经济海水鱼类。 本论文研究了大菱鲆消化道的发育及其消化生理的变化，同时结合对蛋白酶基因在发育过程中的起源及定位进行了研究具体，结果如下： 1、大菱鲆的消化道在初孵仔鱼为一条未分化的线性消化管。当仔鱼开口之后（3 DAH, days after hatching），消化道逐渐发育为口咽腔、食道、胃和肠等部分。食道在2 DAH末端开始开始膨大，上皮细胞逐渐转换成柱状细胞，3 DAH时膨大的部分逐渐发育成胃。胃腺在16 DAH出现，标志着胃的组织结构发育完善。肠道在2 DAH开始分化，3 DAH时就分化出前中肠和后肠，至27日龄时基本发育完善。肝胰脏的原基在2 DAH出现，并在3 DAH 出现酶原颗粒，肝胰脏在17日龄时基本发育完善。 2、通过蛋白酶活性的检测发现：大菱鲆的胃蛋白酶活性出现的时间在22 DAH（43.14±7.57 U/prot），晚于胃腺出现的时间，表明胃的功能化与胃的组织学发育并不同步，胃的功能化要晚于组织学的发育。随后胃蛋白酶的活性随着个体的发育逐渐增加。大菱鲆胰蛋白酶原在未受精卵及胚胎时期均能检测到其活性，并且在未受精卵的中胰蛋白酶的比活性最高（1320.66±55.63 U/prot）在随着胚胎发育逐渐下降，至原肠期时降到最低(77.37±0.58 U/prot)。然后又逐渐上升到18 DAH时已达（1061.80±102.76 U/prot），至22日龄时又迅速下降(213.60±59.65 U/prot)，此后保持在一个平稳的水平。 3、克隆获得了大菱鲆胃蛋白酶原 A（pepsinogen A, PGA）、胃蛋白酶原C（pepsinogen C，PGC）cDNA序列全长。并且使用RT-PCR及原位杂交检测了其在大菱鲆早期发育过程中的表达情况。对大菱鲆PGA (tPGA)、PGC（tPGC）蛋白序列分析发现，tPGC较tPGA更加保守，而tPGA在对蛋白底物的结合能力更强。通过RT-PCR及荧光定量PCR检测发现tPGA及tPGC均在22 DAH 开始表达，在消化道中，tPGA与tPGC均在食道末端与胃的贲门处开始表达。在表达量上，tPGC在发育早期的表达量较高，而tPGA在成鱼中的表达量较高。另外，在不同组织中，tPGA与tPGC在食道和胃的表达量最高，其次在在卵巢和肌肉中也有微量的表达。 4、克隆获得了大菱鲆胃质子泵基因（H+/K+ATPase）α亚基的cDNA全长序列。并且检测了其在早期发育过程中的表达情况，发现大菱鲆H+/K+ATPase的表达时序跟tPGA、tPGC的表达时序一致，都是在22 DAH开始在食道末端和胃的贲门部位表达。 5、克隆获得了大菱鲆胰蛋白酶原（Trypsinogen, TG）基因的cDNA序列全长。检测了其在大菱鲆早期发育过程中的表达情况，大菱鲆胰蛋白酶原基因（tTG）的表达贯穿于大菱鲆的整个发育过程。在不同时期发育的卵母细胞中均能检测到tTG的表达，受精后，tTG的表达量随着胚胎发育逐渐降低，至原肠期达到最低，此后逐渐上升，至25 日龄左右时，表达量突然降低。tTG基因的表达量与胰蛋白酶原活性的变化趋势基本一致。另外，通过对tTG在大菱鲆胚胎中的定位分析发现，在胚胎发育早期，tTG在胚胎中弥散表达，并且在卵黄囊的系膜上也有分布。至孵化期时，tTG的分布逐渐向消化道和头部位置集中。