海洋经济鱼类生殖细胞的起源及移植技术研究

• Main Author: 周莉
• Other Authors: 李军
• Format: Other/Unknown Material
• Language: Chinese
• Published: 2021
• Subjects: 大菱鲆; 许氏平鲉; 原始生殖细胞; 移植; 精原干细胞; 理学::海洋科学; Vasa; Scophthalmus maximus
• Online Access: http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/170650

生殖细胞将遗传信息传递给下一代，对种族延续十分重要。近年来，鱼类生殖细胞移植技术得到快速发展， 结合冷冻保存技术， 在濒危物种保护和代理养殖方面展现广阔的空间。然而，目前关于鱼类生殖细胞发生发育及移植方面研究大多集中在模式及淡水鱼类，对于海洋经济鱼类涉及较少。 大菱鲆 （ Scophthalmus maximus ）、夏鲆 （ Paralichthys dentatus ） 、牙鲆 （ Paralichthys olivaceus ） 以及 许氏平鲉 （ Sebastes schlegelii ） 等鱼类 是我国重要 海洋经济养殖品种 ，随着长期的人工养殖，逐渐出现了种质资源退化 ，遗传多样性降低，生殖力低下 等问题。本研究以上述 鲽形目及鲉形目 鱼类为研究对象，开展生殖细胞起源 模式 及移植技术等研究。促进对鱼类生殖细胞起源、分化、成熟机制的 认知 ，为种质资源的保存和高效开发利用开辟新途径。具体研究结果如下： 1.许氏平鲉生殖细胞的起源和发育 借助 许氏平鲉 vasa 基因原位杂交， 分析其在生殖系的表达。 vasa RNA 在分裂期均匀分布于卵裂球； 信号在原肠早期出现聚集，胚盾区域似乎比其它区域强， 直到原肠晚期， 一些 vasa 阳性细胞首次出现在外包底部， 此时原始生殖细胞（ PGCs ）形成； PGCs 聚集在狭窄早期神经胚的背侧，沿体轴的前部随机排列，并向后移动，于体节期松散排列在胚体两侧； PGCs 在心跳期形成两个簇，腹部两侧对齐，继续轴向迁移，最后于孵化期聚集在肠的背部 , 脊索的腹侧。仔鱼出生后 ， PGCs 逐渐 被体细胞完全包围，沿中肾管迁移，并于第 10 天 迁移至 原始生殖嵴，形成原始性腺。追踪整个性腺发育过程， vasa 持续表达在 早期生殖细胞。本研究首次揭示海洋胎生鱼类生殖细胞的起源迁移模式，与 生殖质（ vasa RNA ）失去早期定位的真真骨鱼类（ Euteleostei ）青鳉相似，不同于生殖质早期定位在卵裂沟的 骨鳔鱼类（ Ostariophysans ） 斑马鱼。 2. 硬骨鱼类 vasa / nanos3 3' UTR 功能分析 母源基因的 3' UTR 具有定位功能，融合荧光蛋白，可以体内追踪鱼类 PGCs 。构建包括大菱鲆、许氏平鲉在内几种常见硬骨鱼类 vasa / nanos3 3'UTR 嵌合 mRNA ，注入了 1-2 细胞受精卵，实现了大菱鲆等鱼类 PGCs 的活体标记。这种简单、快速、无基因污染的标记方法适用于经济鱼类。分析几种鱼类 vasa 3'UTR 中保守元件，探讨了参与定位的关键因素。具有早期定位的斑马鱼 vasa 3'UTR 含有丰富定位元件，可以标记多种鱼类 PGCs 。而失去早期定位的硬骨鱼类，如真鲷（ Pagrus major ）和海水青鳉（ Oryzias melastigma ） vasa 3'UTR 不能标记斑马鱼和大菱鲆 PGCs 。但是许氏平鲉 vasa 3'UTR 因具有斑马鱼特有的 3 个重要保守元件（ M10 、 M12 、 M19 ），可能参与斑马鱼 PGCs 标记。 3.鲽形目精原干细胞的移植 从冷冻保存的牙鲆、夏鲆、大菱鲆整个精巢中分离纯化精原干细胞（ SSCs ）， PKH-26 标记，腹腔移植入孵化 22 d 内牙鲆三倍体仔鱼，探索亲缘关系由近及远（种内、属内、科间）的细胞移植。荧光跟踪发现供体细胞在移植后 14 天（ 14dpt ）几乎都迁移到了原始生殖嵴，在 50 dpt 随机分布并整合到发育中的受体性腺；组织学展示在种内和属内移植中，受体分化为雄性和雌性嵌合体，而在科间移植中，受体分化为雄性和兼性嵌合体；原位杂交和免疫组化鉴定大菱鲆生殖细胞在三倍体牙鲆受体中存活及增殖，证明嵌合体除了包括牙鲆早期的卵母细胞和雄性生殖细胞外，还包括大菱鲆精原和精母细胞；随后，通过扫描电镜、 PCR 、人工授精进一步证实了供体来源精子及其功能。而且，兼性嵌合体可以成熟并产生大菱鲆功能性的精子。综合以上鉴定，移植效率为大菱鲆 - 牙鲆（ 33-50 ％），夏鲆 - 牙鲆（ 75-95 ％）和牙鲆 - 牙鲆（ 100 ％）。本研究首次突破了海洋鱼类科间移植，并缩短了大菱鲆精子的成熟时间。 4.鲉形目精原干细胞的移植 从冷冻保存的许氏平鲉整个精巢中分离出 SSCs ， PKH-26 标记，腹腔内移植入孵化 5-10 d 的同种仔鱼。荧光观察供体细胞在 20dpt 时迁移至生殖嵴附近（ 100% ），在 90dpt 时已嵌入受体性腺（ 90% ）。组织学显示受体性腺正常分化，形态与对照没有显著差异。移植 1 年后，微卫星鉴定 29 个受体，种内移植嵌合率达到 82.76% 。同时，分离鲉形目的其它物种朝鲜平鲉（ Sebastes koreanus ）、褐菖鲉（ Sebastiscus marmoratus ） SSCs ...