长牡蛎整合素基因家族成员与互作配体的鉴定及其介导细胞免疫的过程和功能分析

• Main Author: 吕钊
• Other Authors: 宋林生
• Format: Other/Unknown Material
• Language: Chinese
• Published: 2019
• Subjects: 长牡蛎，整合素家族，整合素配体，细胞免疫反应，rgd+血细胞; 地球科学::海洋科学::海洋生物学; 理学; 理学::海洋科学; Crassostrea gigas
• Online Access: http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/156824

无脊椎动物通过有限基因编码的免疫受体介导了复杂的固有免疫反应网络，从而形成其赖以生存的免疫防御能力。关于无脊椎动物关键免疫受体及其功能的研究对深入认识无脊椎动物固有免疫反应的本质具有重要意义。整合素家族（ Integrin family ）是一类重要的免疫受体，广泛地存在于所有多细胞动物中，但目前对其在无脊椎动物固有免疫反应中的作用方式和特点还缺乏系统认知。本研究以软体动物长牡蛎为研究对象，从基因组中系统地鉴定了整合素家族所有成员，并借助比较生物学、生物信息学、分子生物学、免疫学等技术手段，分析了长牡蛎整合素家族成员的结构和进化特征，阐述了其参与配体结合和介导细胞免疫反应的方式和特点，探讨了其与配体互作并调节多种细胞免疫反应的分子基础和可能机制，具体实验结果如下： 长牡蛎整合素家族由 8 个 α 亚基和 3 个 β 亚基组成，至少可形成 8 个功能配对的整合素异源二聚体，该数目多于线虫、果蝇以及海葵等无脊椎动物。在结构域组成上，相比人和果蝇的整合素，长牡蛎整合素 α 和 β 亚基都含有保守的跨膜域，其中 α 亚基除了拥有保守 INA 、 Intα 结构域之外，有些成员还携带了特异的 FG-GAP 、 sulfotransfer 结构域； β 亚基除了拥有保守的胞外 INB 结构域之外，有些成员在其胞内还插入了额外的 INB 结构域。除此之外，长牡蛎整合素 α 和 β 亚基保守的 INA 和 INB 结构域具有高度变异性：首先，在序列长度上，长牡蛎 INA 和 INB 结构域分别由 146~499 个氨基酸残基和 225~354 个氨基酸残基构成，长度变异较大。其次，长牡蛎 INA 和 INB 结构域的序列变异性大，其中长牡蛎 INA 结构域之间的序列相似性和一致性分别为 23.8% 和 0.2% ，而长牡蛎 INB 结构域之间的序列相似性和一致性分别为 69.6% 和 14.9% 。再者， SWISS-MODEL 建模分析显示，所有长牡蛎 INA 结构域不具备保守且典型的 “ 大腿 ” 和 “ 小腿 ” 样结构，而大多数 INB 结构域除了携带保守的由 6~8 个 α 螺旋围绕 4~6 个 β 片层而形成的中心结构， 还额外插入了不同数目的 α 螺旋或 β 片层结构， 也表现出高度的变异性。作为重要的免疫受体，长牡蛎整合素家族成员数目发生扩张，结构多样且变异性高，可能为其行使多样化的免疫功能提供了重要的结构基础。 在分子进化上，长牡蛎整合素家族 8 个 α 亚基中， α 亚基 CGI_10012356 与 RGD 结合型 α 亚基聚为一支； α 亚基 CGI_10013155 与层粘连蛋白结合型 α 亚基聚为一支；其余 6 个 α 亚基明显与其他进化分支分离而单独聚类，命名为牡蛎特有型 α 亚基分支。相比人的整合素 α 亚基，长牡蛎整合素家族 α 亚基缺乏 LDV 结合型 α 亚基，以及含 αI 结构域的 α 亚基分支。在 β 亚基的系统进化树中，长牡蛎的 3 个 β 亚基和昆虫纲 βV 进化关系相对较近且聚在一个分支，而与同属软体动物门的光滑双脐螺的 β 亚基发生明显分歧。推测长牡蛎整合素家族 α 、 β 亚基分别经历了独特的进化历程，可能已经高度进化为独特分支。 长牡蛎整合素家族成员能结合 RGDCP 、 LDVCP 、 GFOGERCP 和层粘连蛋白等多种配体，尤其是尽管长牡蛎整合素家族在进化上缺乏 LDV 结合型以及 GFOGER 结合型的成员，但依然能结合特异配体 LDVCP 和 GFOGERCP ，从而实现了在配体结合功能上比较完备的分工。长牡蛎整合素家族成员介导血细胞吞噬、迁移、包囊反应等多种细胞免疫反应时，也表现出了明显的功能分化，即只有特定的整合素家族成员在特定的细胞免疫反应中起主要作用。以长牡蛎整合素家族 β 亚基（ CGI_10012179 ）为例，抗体封闭血细胞表面 β 亚基（ CGI_10012179 ）后，血细胞吞噬、迁移和包囊反应的活性显著下降，且显著比其他 3 个代表性的 α 亚基抗体的抑制作用强，表明长牡蛎整合素家族成员介导复杂的细胞免疫反应时极大地依赖于 β 亚基。另外一方面，多个长牡蛎整合素家族成员在特定的细胞免疫反应中还展现出协作的特点，同时某些整合素家族成员还参与了多种细胞免疫反应，从而大大增加了长牡蛎整合素家族成员参与细胞免疫反应的多样性。 借助 pull-down 以及质谱分析技术，鉴定了长牡蛎整合素 α 亚基的一个血清配体—— Cg PEPCK ，它是一个保守的烯醇式丙酮酸激酶，具有保守的 GTP 结合活性，在胞内糖异生过程当中发挥重要作用。除此之外， Cg PEPCK 可以被分泌至血清，兼具识别 LPS 、 PGN 以及多种病原微生物的免疫功能。另外，发现 β 亚基的一类血清配体可能是众多结构和功能相似的 C1qDC 蛋白，其中 Cg C1qDC-5 可以作为分泌型 ...