长牡蛎Toll样受体介导的抗病毒相关基因的功能及调控机制研究
长牡蛎 （ Crassostrea gigas ） 是我国重要的海水养殖经济贝类 ，但夏季大规模死亡事件时有发生，造成的经济损失直接影响了我国牡蛎养殖产业的可持续发展。已有研究证实，牡蛎疱疹病毒（ Ostreid Herpevirus -1 ， OsHV-1 ）是造成长牡蛎大规模死亡的重要病原微生物。因此，深入研究长牡蛎抗病毒免疫防御机制对探索病毒防治方法有重要的意义。 Toll- 样受体（ Toll-like receptor ， TLR ）是一类重要模式识别受体（ Pattern recognition receptor ， PRR ），在识别以及清除病原微生物中有重要作用。 TLR 信号...
| Main Author: | |
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| Other Authors: | |
| Format: | Other/Unknown Material |
| Language: | Chinese |
| Published: |
2018
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| Online Access: | http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/154541 |
| Summary: | 长牡蛎 （ Crassostrea gigas ） 是我国重要的海水养殖经济贝类 ，但夏季大规模死亡事件时有发生，造成的经济损失直接影响了我国牡蛎养殖产业的可持续发展。已有研究证实，牡蛎疱疹病毒（ Ostreid Herpevirus -1 ， OsHV-1 ）是造成长牡蛎大规模死亡的重要病原微生物。因此，深入研究长牡蛎抗病毒免疫防御机制对探索病毒防治方法有重要的意义。 Toll- 样受体（ Toll-like receptor ， TLR ）是一类重要模式识别受体（ Pattern recognition receptor ， PRR ），在识别以及清除病原微生物中有重要作用。 TLR 信号通路在脊椎动物中研究较为透彻，然而在无脊椎动物的研究中还处于探索阶段。已有研究发现，在若干无脊椎动物中 TLR 基因有明显的扩张现象，在基因组中预测到了上百个 TLR 同源序列（长牡蛎，小头虫，紫海胆），暗示 TLR 通路在无脊椎动物中可能存在功能分化。目前关于软体动物 TLR 信号通路的研究有限，所得结果较为简单零散。深入了解这些基因在通路中的作用机制有助于我们更好地认识 TLR 信号通路在抗病毒天然免疫防御过程中的作用。 本研究利用分子生物学和细胞生物学等方法对长牡蛎 TLR 信号通路关键基因的作用机制进行了探究。大量研究表明在脊椎动物中 TLR 通过 TIR-TIR 结合作用招募接头分子。我们首先以 OsHV-1 爆发期表达上调的 4 个 TLR 基因为研究对象，通过酵母双杂交文库筛选了可能与之存在相互作用的蛋白。 结果发现，这 4 个 TLR 蛋白只有 CgTLR-27513 筛选到的接头分子蛋白中有 TIR 结构域，因此我们后续实验则以该 TLR 基因为主要研究对象。而另外三个 TLR 筛选到的潜在互作蛋白通过功能注释发现，这些蛋白主要参与了 细胞迁移 、 呼吸作用和细胞因子运输 ，因此，我们推测长牡蛎 TLR 基因功能表现出多样性。 筛选到的与 CgTLR-27513 互作蛋白中有 3 个具有 TIR 结构域的蛋白，其中两个是已经被克隆鉴定的接头分子 MyD88 ，另一个是只具有 TIR 结构域的 MyD88-like 蛋白，将其命名为 CgMyD88s 。我们发现， CgMyD88-1 和 CgMyD88-2 能够自身或相互之间结合形成同源或异源二聚体参与 CgTLR-27513 介导的抗病毒免疫过程。除此之外， CgMyD88-1 在 LPS 及 poly(I:C) 刺激下在细胞质中凝聚成团，而 CgMyD88-2 在 LPS 及 poly(I:C) 刺激下在细胞膜和细胞质中均有凝结，说明 CgMyD88-1 和 CgMyD88-2 在功能上存在分化。结合实验室以往数据， CgMyD88s 在 OsHV-1 μvar 刺激后呈现先下降后上升的表达模式，与 CgMyD88-1 和 CgMyD88-2 的表达模式正好相反。免疫共沉淀结果显示， CgMyD88s 只能够与 CgTLR-27513 结合而不能与 CgMyD88-1 以及 CgMyD88-2 结合。干扰 CgMyD88s 表达后， CgMyD88-1 和 CgMyD88-2 均有明显的表达上调，并且 CgMyD88s 不仅不能激活 NF-κB 的转录还会抑制 CgMyD88-1 和 CgMyD88-2 蛋白对 NF-κB 的转录激活作用。因此，我们推测 CgMyD88s 与 CgMyD88-1 以及 CgMyD88-2 蛋白存在竞争作用。 其次，我们克隆了 MyD88 下游 IRAK 家族基因，并根据结构特征将其命名为 CgIRAK4 。该基因在 OsHV-1 μvar ，溶藻弧菌和 poly(I:C) 刺激下均有明显的表达上调，并且能够通过与 CgMyD88-1 和 CgMyD88-2 的死亡结构域结合参与到 TLR 介导的免疫过程。然而 CgIRAK4 并不能激活 NF-κB 的转录活性，还会抑制 CgMyD88-1 和 CgMyD88-2 蛋白对 NF-κB 的转录激活作用。说明 CgIRAK4 参与了 MyD88 依赖型 TLR 信号通路的负调控过程。 最后，我们首次在长牡蛎中克隆了 MyD88 非依赖型信号通路（ TLR-TRIF ）下游的 TBK1 和 IKKε 基因，这两个基因在 OsHV-1 μvar ，溶藻弧菌和 poly(I:C) 刺激下均有明显的表达上调。 CgTBK1 在胞质中表达且需要与 CgSTING 结合激活 IFN-β 的转录活性； CgIKKε 自身能够诱导 NF-κB 及 IFN-β 启动子的激活，而 CgIKKε 激酶结构域截短体则会丧失该激活作用。虽然在无脊椎动物中还没有 MyD88 非依赖型信号通路的相关报道，但是存在 TLR-TRIF 下游的 TBK1 和 IKKε 基因参与天然免疫过程。 ... |
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