多组学研究大西洋鲑抵御杀鲑气单胞菌的分子机制

• Main Author: 刘鹏飞
• Format: Other/Unknown Material
• Language: Chinese
• Published: 2018
• Subjects: 大西洋鲑; 杀鲑气单胞菌; 代谢组学; 蛋白质组学; 磷酸化蛋白组学; 理学; Eta; Salmo salar
• Online Access: http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/154497

摘 要 杀鲑气单胞菌（ Aeromonas salmonicida , A. salmonicida ），作为最主要的一种可以引起鱼体疖疮病的细菌，正影响着全世界范围内的鲑科鱼类的养殖，尤其是大西洋鲑 （ Salmo salar ） 的养殖。为了增加我们对这个病原菌的了解，同时从大西洋鲑体内筛选出可以用来抵抗该病菌侵袭的潜在生物指示因子，我们采用代谢组学、蛋白质组学、磷酸化蛋白质学和分子生物学的方法进行实验分析和筛选。由于该细菌主要发病的器官是鱼体的重要 免疫 器官 - 肾脏组织。因此，我们将肾脏作为本实验研究的主体。另外，我们从实验分析的组学数据中筛选出醛脱氢酶家族的 7A1 蛋白（ ALDH7A1 ），并将其进行蛋白重组表达纯化。发现其在大西洋鲑感染杀鲑气单胞菌的早期，有着明显的抗杀鲑气单胞菌的能力并且可以显著降低鱼体的死亡率。所有得到的主要结果如下所示： 1 代谢组学对感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑的肾脏组织进行分析 本部分实验中，我们首次通过 1 H 核磁共振（ NMR ）光谱分析法来分析感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑的肾脏组织中代谢物的变化情况。 通过 NOESYPR1D 光谱 、 主成分分析（ PCA ）和正交偏最小二乘判别分析模型（ OPLS-DA ）两种多元化分析 （ 刘鹏飞 ， 2015 ） ， 对 7 天和 14 天的 高浓度 感染实验组 与 对照组 中的实验大西洋鲑的肾脏组织 进行比较分析。本部分实验最主要的目的就是筛选出可以抵抗杀鲑气单胞菌感染鱼体的重要代谢物，同时进一步了解该病菌在大西洋鲑体内的致病机理。经分析，我们发现 分布在 T CA 循环、糖酵解 / 糖异生、色氨酸代谢和尿素循环等四大代谢通路中 的 延 胡索酸盐、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、天冬氨酸盐、胆碱、磷酸胆碱和甜菜碱等 9 种差异代谢物 ， 可能是由于杀鲑气单胞菌的刺激和影响，而在鱼体内出现明显增高的 表达 趋势。 2 蛋白质组学对感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑的肾脏组织进行分析 本部分实验通过高通量蛋白质组学（ iTRAQ 标记法），对在 7 天和 14 天两个高、低浓度不同的感染 杀鲑气单胞菌的 实验组中 的大西洋鲑的肾脏组织进行分析和鉴定。我们通过 LC/MS/MS 质谱仪分析后共筛选出 4009 个总蛋白。随后，我们将 140 个差异极显著的蛋白（ 差异倍数 ≥ 1.5 和 P < 0.01 ）进行蛋白网络互作分析，共筛选出 39 个蛋白可以作为大西洋鲑抵抗杀鲑气单胞菌侵袭的潜在生物指示因子。然后，我们从中筛选了 9 个重要的差异蛋白进行实时定量 PCR 来检验这些基因的转录水平表达情况 ，发现 与蛋白水平 变化基本 相同。本实验是第一次通过 iTRAQ 技术对感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑的肾脏组织进行分析鉴定，最终我们推测 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶、醛脱氢酶家族 7A1 、醛脱氢酶家族 9A1 、 L- 乳氨酸脱氢酶 B 链、羟烷基 - 辅酶 A 脱氢酶、 β- 血红蛋白亚基、 α-4- 血红蛋白亚基、 T- 复合蛋白 1-eta 亚基、磷酸丙糖异构酶 -A 和补体因子 B 等 10 个蛋白 可作为潜在的生物指示因子进行深入研究 。 3 ALDH7A1 蛋白可以保护大西洋鲑抵抗杀鲑气单胞菌 醛脱氢酶家族（ ALDHs ）是一个具有解毒功能的超级蛋白家族，同时该家族蛋白在维持上皮细胞内稳态，并保护细胞免受醛类毒素的影响和抗药性上有着重要的作用。然而，对于这些解毒蛋白如何行使功能，我们至今还无从得知。在本部分的研究中，我们表达并纯化了 ALDH7A1 蛋白来研究其在感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑时的作用。我们 首 先通过 SDS-PAGE 和 western blot 的方法来验证重组表达的 ALDH7A1 （ rALDH7A1 ）蛋白。该蛋白分子量大概为 58.9 kDa ，等电点为 7.09 ，且 该重组蛋白并无信号肽分子， 而 氨基酸序列中只有一个低复杂区域（ 141 yvegvgevqeyvdv 153 ）。另外， ELISA 的结果表明， rALDH7A1 可以与杀鲑气单胞菌结合。 且 ALDH7A1 的基因在鱼的肾脏、肝脏、肠、和血液中表达最高 （依次降低） ， 而 在鳃和脾中表达最低。 随后再 通过实时荧光定量 PCR 检验大西洋鲑的肾脏组织后，我们发现注射 rALDH7A1 蛋白的感染杀鲑气单胞菌的实验组中，在感染早期，杀鲑气单胞菌的 拷贝 数明显低于同浓度的感染实验组。与此同时，我们测定了在肾脏和脾脏组织中， NF-k B 、 P-38 MAPK 、 caspase-3 和 TNF - α 等 4 个基因的表达情况。结果表明，主要在 72 h 的 rALDH7A1 + 高 / 低 浓度感染组的 肾脏和肝脏 中，这 4 个 基因受到 rALDH7A1 蛋白的作用表达量明显高于其他实验组，而在脾脏组织中则是在 12 h ...