miRNA在长牡蛎环境胁迫应答中的调控作用

• Main Author: 陈浩
• Other Authors: 宋林生研究员
• Format: Other/Unknown Material
• Language: Chinese
• Published: 2017
• Subjects: 长牡蛎; 表观遗传; 潮间带适应机制; 神经内分泌免疫调节网络; 免疫应答; 干露胁迫; 地球科学::海洋科学::海洋生物学; 生物学::分子生物学; Crassostrea gigas
• Online Access: http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/136543

潮间带区域环境复杂多变，长牡蛎作为典型潮间带生物，终生营固着方式生存于潮间带区域，进化形成了较强的抗病原侵染、抗干露胁迫等抗环境胁迫机制。miRNA作为重要的表观调控手段，能够在转录后水平调控基因表达，参与免疫应答等生理过程。然而目前对miRNA的研究主要集中于高等动物或其他模式生物中，在无脊椎非模式生物中的研究还处于起步阶段。本研究以长牡蛎为材料，通过分子生物学、细胞生物学与生物信息学的手段，鉴定了长牡蛎血淋巴细胞miRNA，并概述了其在神经内分泌免疫调节系统中的作用；基于长牡蛎免疫过程，筛查了关键代表性miRNA，并解析了其在病原胁迫下介导的免疫应答调控机制；通过多组学整合分析，筛选了干露胁迫相关miRNA，探究了其介导的干露适应调节机制。 通过二代测序技术结合生物信息学分析，对长牡蛎miRNA进行了全基因组范围的筛查及鉴定，在长牡蛎中发现了331条miRNA，其中76条为保守miRNA，255条为全新miRNA，长牡蛎中鉴定出的miRNA数量为已知贝类中最多。有38条长牡蛎miRNA同时被发现响应免疫调质乙酰胆碱ACh或去甲肾上腺素NE刺激，并能够靶定355个长牡蛎基因，其中包括免疫识别受体，免疫通路信号分子，免疫效应分子及神经内分泌相关分子等。 从长牡蛎中鉴定出保守miRNA cgi-miR-92d，其表达水平在免疫应答早期显著下调，在免疫应答后期迅速升高。CgLITAF3作为长牡蛎LITAF同源基因及cgi-miR-92d的靶基因，其表达水平在免疫应答早期迅速上升，在免疫应答后期显著下降。体外双荧光实验结果表明，cgi-miR-92d能够通过结合CgLITAF3编码区抑制其表达。体外过表达实验表明，CgLITAF3能诱导HEK293T细胞中HsTNF-α表达，且诱导效果受cgi-miR-92d抑制。CgTNF作为长牡蛎TNF-α同源基因，其表达水平在免疫应答早期显著升高，而在免疫应答后期显著下降，且趋势晚于CgLITAF3。研究发现，病原刺激后，敲减长牡蛎体内cgi-miR-92d能够显著降低CgLITAF3及CgTNF表达水平。 scaffold42648_5080是长牡蛎特有miRNA，编码于长牡蛎基因内含子区域。scaffold42648_5080能响应LPS刺激且在免疫应答早期显著下调。同时能够靶定包括CgILK在内的31个长牡蛎基因，参与细胞通讯、定位、应激反应等调控过程。其中，CgILK作为长牡蛎integrin通路中核心信号转导分子，同样能响应LPS刺激且显著上调。通过双荧光素酶报告基因实验证实，scaffold42648_5080能够在体外结合CgILK 3’-UTR，并抑制其表达。在免疫应答过程中，长牡蛎血细胞迁移能力随CgILK表达量的升高或降低而发生相应变化，在体内敲减scaffold42648_5080后，CgILK表达水平显著升高，长牡蛎血淋巴细胞迁移能力显著升高。 免疫细胞吞噬作用是机体清除外来病原的重要机制，受NF-κB等通路调控。灿烂弧菌刺激后长牡蛎血淋巴细胞吞噬能力显著升高而NF-κB通路中核心抑制因子CgIκB2表达水平显著降低。体内敲减CgIκB2基因后，长牡蛎血淋巴细胞吞噬能力显著升高。长牡蛎能够编码一个无脊椎动物特有的miRNA cgi-miR-2d。灿烂弧菌刺激后，其表达水平迅速升高，趋势与CgIκB2基因相反。生物信息学分析及双荧光素酶报告基因实验显示，cgi-miR-2d能够结合CgIκB2 3’-UTR并抑制其表达。同时，在长牡蛎体内过表达cgi-miR-2d后，CgIκB2基因表达水平显著降低，细胞吞噬能力显著升高；在长牡蛎体内敲减cgi-miR-2d后，CgIκB2基因表达水平略有升高，细胞吞噬能力迅速降低。 乙酰胆碱ACh是胆碱能神经系统主要的神经递质，也是重要的免疫调质。贝类具有原始的胆碱能神经免疫调节系统，并能参与调控其免疫反应。研究发现，灿烂弧菌刺激12小时后，长牡蛎血淋巴细胞中ACh显著升高，同时长牡蛎胆碱转运体同源基因CgCTL1表达量在免疫应答前期降低，在免疫应答后期恢复正常。敲减CgCTL1后，长牡蛎血淋巴细胞内胆碱及细胞外ACh含量显著降低，CgTNFs表达水平显著升高。生物信息学分析及双荧光实验表明，cgi-miR-2d能够结合CgCTL1 3’-UTR并抑制其表达。体内过表达cgi-miR-2d后CgCTL1表达水平显著降低，血淋巴细胞内胆碱转运与ACh合成释放迅速下降，CgTNFs表达水平升高；体内敲减cgi-miR-2d后，CgCTL1表达水平显著升高，血淋巴细胞内胆碱含量显著增加，细胞外ACh含量及CgTNFs表达水平保持不变，细胞抗菌能力显著降低。 ...