| Summary: | Les organismes vivants ont colonisé pratiquement tous les environnements de la planète, que ce soit les régions polaires et le permafrost arctique gelés en permanence, ou les cheminées hydrothermales des profondeurs marines, solfatares et sources chaudes. La vie microbienne dans ces conditions extrêmes nécessite assurément de nombreuses adaptations cellulaires. Les études antérieures ont porté principalement sur l'adaptation de l'activité enzymatique, la stabilité et l'expression des protéines, ou encore la fluidité membranaire. Or, un élément-clé de ces adaptations, jusqualors inexploré, est l'acquisition de la conformation finale et biologiquement active des protéines, assistée par les chaperons et les catalyseurs de repliement. L'objectif de ma thèse était d'identifier les adaptations fonctionnelles qui permettent au trigger factor (TF) d'être actif dans la vaste gamme des températures biologiques. Comme le TF est le premier chaperon moléculaire interagissant avec pratiquement tous les polypeptides naissants synthétisés par le ribosome bactérien et quil possède également une activité PPIase, il représente un modèle approprié pour cette étude. Afin de couvrir la quasi-totalité des températures rencontrées par les organismes vivants, nous avons comparé trois trigger factors homologues issus du psychrophile antarctique Pseudoalteromonas haloplanktis (PhTF), du mésophile Escherichia coli (EcTF) et de lhyperthermophile Thermotoga maritima (TmTF). Leurs capacités à prévenir l'agrégation (activité holdase) et à promouvoir le repliement (activité foldase) ont été analysées in vitro à différentes températures en utilisant plusieurs substrats. Bien que EcTF et TmTF soient tous deux capables dempêcher l'agrégation de la GAPDH à 20°C, PhTF nécessite une incubation préalable sur glace et une température expérimentale plus basse pour effectuer cette fonction. Dautre part, lanalyse de la réactivation de la GAPDH montre que PhTF ne présente qu'une activité foldase modérée, même à basse température, et que TmTF inhibe fortement le folding aux rapports élevés chaperon/substrat. Des résultats comparables ont été obtenus lors du repliement de la GFP à différentes températures. EcTF, pour sa part, améliore le repliement des substrats lorsqu'il est présent à faible concentration et l'inhibe à haute concentration. Toutefois, ce phénomène dinhibition ne se produit pas au cours du folding de la GFP à basse température. Une coopération possible entre chaque TF et la chaperonine GroEL/ES dE. coli a également été analysée lors du repliement de la GFP. EcTF et GroELS semblent être en compétition pour la liaison à la GFP, tandis que PhTF et GroELS ont un effet additif sur le taux de refolding. Le comportement de TmTF est assez inattendu, car le taux de repliement est significativement augmenté lors de lajout simultané de la chaperonine et du TF hyperthermophile, ce qui suggère une action coopérative. Pour chaque TF, un titrage à lANS et lanalyse de la liaison à une protéine déstructurée par ITC ont également été réalisés. Les résultats indiquent une cavité chaperon plus hydrophobe chez TmTF, tandis que la liaison de PhTF à lα-caséine, indétectable, suggère une affinité très faible de ce chaperon pour les protéines déstructurées. Par conséquent, ces trigger factors affichent des propriétés remarquablement distinctes liées au mode de vie de la bactérie-source. Le trigger factor hyperthermophile lie fortement les protéines modèles lors de leur repliement et les protège contre le misfolding et l'agrégation induits par la chaleur. Il contrebalance la vitesse de repliement élevée imposée par la chaleur et agit comme un transporteur de protéines partiellement repliées en vue de les livrer aux chaperons en aval qui assurent la maturation finale. En revanche, le trigger factor psychrophile semble conserver uniquement la fonction primaire des TF en tant que chaperon associé au ribosome, retardant le repliement prématuré des polypeptides naissants. Son activité foldase à l'état non lié n'est vraisemblablement pas indispensable car les basses températures biologiques réduisent la vitesse de repliement des protéines et limitent le misfolding et l'agrégation. Les propriétés chaperon du trigger factor mésophile reflètent également son rôle de cold shock protein chez E. coli. Lactivité PPIase des TF envers des substrats peptidiques et protéiques a été testée. PhTF et EcTF présentent une spécificité de substrat similaire, mais le TF psychrophile montre une activité dix fois moindre envers les tetrapeptides. Cependant, dans les réactions de folding des protéines modèles, l'efficacité catalytique de PhTF est similaire à celle de EcTF, en particulier à basse température. A cet égard, l'activité de PPIase de PhTF ne présente pas les caractéristiques habituelles des enzymes adaptées au froid, à savoir une activité plus élevée à basse température. Cependant, ceci est probablement compensé par la surexpression du TF psychrophile chez P. haloplanktis à basse température. TmTF affiche une activité de PPIase faible mais significative, ce qui peut s'expliquer par le fait que la vitesse de prolyl-isomérisation non catalysée augmente fortement avec la température et une haute activité catalytique de TmTF nest peut-être pas indispensable à la survie. Enfin, EcTF assure le repliement des protéines nouvellement synthétisées à 37°C. A cette température, la prolyl-isomérisation constitue encore une étape limitante du repliement protéique, par conséquent un chaperon et une PPIase hautement actifs sont requis. English version : Living organisms have colonized nearly all environments on earth, from the permanently frozen polar regions or the arctic permafrost, to the extremely hot deep-sea hydrothermal vents, solfatares or hot springs. Microbial life under these extreme environmental temperatures obviously requires a vast array of adaptations at all cellular levels. Previous studies focused mainly on the adaptation of enzyme activity, protein stability and expression, or membrane fluidity. However, a key determinant of these adaptations is the acquisition of the final, biologically active conformation of proteins aided by chaperones and folding catalysts, which remains almost unexplored. The aim of my thesis was to identify the functional adaptations that enable trigger factor (TF) to be active in the wide range of biological temperatures. As TF is the first molecular chaperone interacting with virtually all nascent polypeptides synthesized by the bacterial ribosome and also possesses a PPIase activity, it represents a suitable model for this study. To cover nearly all temperatures encountered by living organisms, we compared three structurally homologous trigger factors from the Antarctic psychrophile Pseudoalteromonas haloplanktis (PhTF), the mesophile Escherichia coli (EcTF) and the hyperthermophile Thermotoga maritima (TmTF). Their abilities to prevent aggregation (holdase activity) and to promote folding (foldase activity) were analyzed in vitro at different temperatures using diverse substrates. While both EcTF and TmTF can prevent GAPDH aggregation at 20°C, PhTF requires ice-cold incubation and a lower experimental temperature to perform such function. Further analysis of GAPDH reactivation shows that PhTF exhibits only moderate foldase activity, even at low temperature, and that TmTF severely inhibits refolding at high chaperone/substrate ratio. Comparable results were obtained with GFP refolding at different temperatures. EcTF promotes substrate refolding when present at low concentration but inhibits folding at high concentration. However, this inhibition is relieved during GFP refolding occurring at low temperature. Next, a possible cooperation between TFs and the chaperonin GroEL/ES from E. coli was analyzed by monitoring GFP refolding. It was found that EcTF and GroELS likely compete for GFP, whereas PhTF and GroELS have an additive effect on refolding yield. The behavior of TmTF was unexpected, as the refolding yield significantly increased in the concomitant presence of the chaperonin and the hyperthermophilic TF, suggesting a cooperative action. For each TF, ANS titration and binding to an unstructured protein were also investigated. The results indicate a more hydrophobic chaperone cavity of TmTF, whereas the undetectable binding of PhTF to α-casein suggests a very low affinity towards unstructured proteins. These trigger factors actually display strikingly distinct properties that are related to the bacterial lifestyle. The hyperthermophilic trigger factor strongly binds model proteins during their folding and protects them from heat-induced misfolding and aggregation. It counteracts the fast folding rate imposed by high temperature and also functions as a carrier of partially folded proteins for delivery to downstream chaperones ensuring final maturation. By contrast, the psychrophilic TF only retains the primary function of trigger factors as a ribosome-bound chaperone delaying premature compaction of nascent polypeptides. Its foldase activity in the unbound state is presumably not essential because low temperature slows down protein folding and prevents misfolding and aggregation. The chaperone properties of the mesophilic trigger factor also possibly reflect its function as a cold shock protein in Escherichia coli. PPIase activity and specificity of TF towards peptides and protein substrates were also analyzed. PhTF resembles EcTF in its substrate specificity but shows an about tenfold lower activity towards tetrapeptides. However, in folding reactions of model proteins, the catalytic efficiency of PhTF is similar to that of EcTF, in particular at low temperature. In this respect, the PPIase activity of PhTF does not display the usual traits of cold-adapted enzymes, i.e. a higher activity at low temperature. However, this is likely compensated by the overexpression of the psychrophilic TF in P. haloplanktis grown at low temperature. TmTF displays a weak but significant PPIase activity, which can be explained by the fact that the rate of uncatalyzed prolyl isomerization increases strongly with temperature and a high catalytic activity of TmTF is possibly not essential for survival. Finally, EcTF ensures the folding of newly synthesized proteins at 37 °C. At this temperature, prolyl isomerization is still rate limiting during protein folding and therefore a highly active chaperone and PPIase is required.
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