| Summary: | 3 Objetivo 3: Estudiar si la fosforilación de mTOR promueve tumorigénesis y metástasis in vitro e in vivo. incompleto NO Generación de mutantes de MTOR fosfo-mimética y fosfo-neutral no tuvo éxito. Todo el objetivo depende de este logro experimental. También afectó el periodo de receso por la pandemia. Otro(s) aspecto(s) que Ud. considere importante(s) en la evaluación del cumplimiento de objetivos planteados en la propuesta original o en las modificaciones autorizadas por los Consejos. RESULTADOS OBTENIDOS:Para cada uno de los objetivos específicos, describa o resuma los resultados. Relacione laspublicaciones y /o manuscritos enviados a publicación con los objetivos específicos. En la secciónAnexos incluya información adicional que considere pertinente para efectos de la evaluación. La extensión máxima de esta sección es de 5 páginas (letra tamaño 10, Arial oVerdana). Objetivo 1: Determinar si CK2 fosforila a mTOR en la región FAT.A partir del vector pcDNA3-Flag mTOR wt (#26603, ADDGENE) la porción c-terminal de la región FAT deMTOR fue clonada en el vector de expresión bacteriano pGEX, quedando la proteína GST fusionada y enmarco de lectura (FATC-GST). A partir de esta secuencia se generó una mutante fosfo-neutral, sustituyendocodones codificantes para las tres serinas putativos blancos de CK2 por los del aminoácido Alanina (FATC AAA-GST). A. esquema de las secuencias aminoacídicas de ambas construcciones, se destacan las serinasputativos blanco de CK2 y su versión mutada por alanina. Los números a la derecha corresponden a laposición en la secuencia aminoacidica de MTOR completo. B. Se indujo la expresión recombinante (IPTG) deestas secuencias en la cepa bacteriana Bl21 y los lisados totales fueron fraccionados mediante SDS-PAGE,observándose una banda prominente cuya migración coincide con el tamaño esperado para ambas proteínasde fusión completas (~62KDa). Estos extractos crudos fueron sometidos a una reacción de fosforilación in vitro(FI) utilizando una holoenzima CK2 de origen comercial e incluyendo ...
|
|---|