Investigations on the environmental distribution & metabolism of methanogenic thermoplasmata - Söllinger, Andrea (2014)
Methan (CH4) ist ein sehr starkes Treibhausgas und wird hauptsächlich von methanogenen Archaea produziert. Diese leben in einer Vielzahl von anaeroben Habitaten und bilden dort CH4 als Endprodukt ihrer anaeroben Atmung. Wiederkäuer gelten als größte anthropogene Methanquelle (Viehzucht), Moor- und Sumpfgebiete als größte natürliche Quellen. Vor kurzem wurde eine bislang unbekannte Ordnung der methanogenen Archaea innerhalb der Klasse der Thermoplasmata entdeckt - die Methanoplasmatales (Mp). Bisher konnte nur ein einziger Vertreter der Mp isoliert werden (aus menschlichem Stuhl), welcher CH4 aus Methanol und Wasserstoff (H2) erzeugt. Des Weiteren weist eine Metatranskriptom-Studie auf in Wiederkäuern lebende Mp hin, welche auch Methylamine zu CH4 reduzieren können. Hauptanliegen und -ziele dieser Arbeit waren (1) die Verbreitung der Mp zu untersuchen, sowie (2) ein Mitglied dieser unzureichend charakterisierten Gruppe aus dem Rinder-Pansen, für physiologische und genomische Analysen, zu isolieren. Ein PCR-Screening nach 16S rRNA Genen (phylogenetische Marker) und mcrA Genen (phylogenetische und funktionelle Marker) von Mp wurde in verschiedenen Mooren (arktische und saure/neutrale warm-gemäßigte Standorte) und tierischen Stuhlproben durchgeführt. Mehr als 40 PCR-Produkte wurden kloniert, über 240 Klone sequenziert und anschließend phylogenetische Bäume berechnet. Mp 16S rRNA Gene wurden in allen arktischen und warm-gemäßigten Mooren sowie in den meisten der untersuchten Tierproben (Elefanten, Rinder, Ratten und Schildkröten) gefunden. In allen Tierproben, arktischen und in einigen der nemoralen Moorböden wurden zusätzlich Mp mcrA Gene detektiert. Die phylogenetischen Analysen beider Markergene zeigten übereinstimmend zwei voneinander klar getrennte Gruppen innerhalb der Mp - eine von Tier-Sequenzen („animal cluster Mp“), die andere von Moor-Sequenzen („wetland cluster Mp“) dominiert. Dies weist auf die Existenz von verschiedenen, speziell auf ihren Lebensraum angepassten Mp Ökotypen hin (freilebende und endosymbiontische Mp). Es sind jedoch weiter Studien nötig, um neben der weiten Verbreitung von Mp auch deren Abundanzen und Aktivität und somit deren globale Rolle in CH4-Emissionen von Mooren und Sumpfgebieten beurteilen zu können. Um Methanoplasmatales aus dem Rinder-Pansen anzureichern, wurde Mp Medium mit Pansen-Flüssigkeit inokuliert und entweder mit Trimetylamin (TMA) oder Methanol inkubiert. Mittels quantitativer PCR wurden Mp Abundanzen und Anreicherungen in den Subkulturen überwacht. Während unterschiedlicher Anreicherungsphasen wurden verschiedenste Methoden zur Steigerung der Mp Anreicherungen angewendet, physiologische Tests durchgeführt und metagenomische Untersuchungen vorgenommen. Die Mikrobiota der ursprünglichen Pansen-Flüssigkeit war bakteriell dominiert - die Mp machten weniger als 1 % der Prokaryonten aus. Allerdings gehörten 40 % aller Methanogenen zur Ordnung der Methanoplasmatales (animal cluster). Mp konnten sowohl mit TMA (bis zu 34 % prokaryontischer 16S rRNA Gene) als auch mit Methanol (bis zu 52 %) angereichert werden. Unter beiden Bedingungen stieg der prozentuelle Anteil der Mp an den Methanogenen auf über 99 %. Nennenswertes Mp Wachstum konnte nur dann beobachtet werden, wenn den Anreicherungskulturen sterile Pansen-Flüssigkeit und H2 beigegeben wurde. Wurden die Bakterien in den Anreicherungskulturen inhibiert, blieb auch das Wachstum der Mp aus. Die metagenomischen Analysen zeigten, dass sich im Laufe der Anreicherungsversuche die Zusammensetzung der bakteriellen und auch der methanogenen Gemeinschaften in den Subkulturen änderte. Die Methanoplasmatales beispielsweise wurden nach 13 Passagen von wetland cluster Mp dominiert (69 %). Aus den Metagenomen konnten zwei partielle Pansen-Mp Genome assembliert werden (ca. 80 % Vollständigkeit), wobei ein Genom große Ähnlichkeiten mit Candidatus Methanomethylophilus alvus (animal cluster Mp) aufwies, das andere mit Methanomassiliicoccus luminyensis (wetland cluster Mp). Sowohl in den Genomen von Ca. M. alvus und M. luminyensis als auch in den Pansen-Mp Genomen sind Gene für die CH4 Bildung aus methylierten Verbindungen (Methanol, Methylamine, Dimethylsulfid) codiert. Jedoch fehlen in den partiellen Pansen-Mp Genomen die nötigen Gene, um aus TMA CH4 erzeugen zu können. Die Pansen-Mp haben demnach die Fähigkeit zur TMA-Metabolisierung im Laufe der Anreicherungsversuche verloren, worauf auch TMA Messungen und spezifische PCR Amplifikationen hinwiesen. Das Vorhandensein der Gene für Acetyl-Coenzym A Synthetase und Pyruvate:ferredoxin Oxidoreductase lässt darauf schließen, dass Acetat den Mp als Kohlenstoffquelle dient. Endosymbiontische Mp, wie die Pansen-Mp, leben sehr wahrscheinlich in engen metabolischen Beziehungen mit anderen Mikroorganismen. Dies würde die während der Anreicherungsversuche deutlich werdende Abhängigkeit der Mp vom bakteriellen Wachstum sowie von der Zugabe der sterilen Pansen-Flüssigkeit, welche verschiedenste für Mp essentielle Verbindungen enthalten könnte, erklären. Die Fähigkeit der Pansen-Mp CH4 aus Methylaminen herzustellen grenzt sie deutlich von anderen, im Pansen vorkommenden Methanogenen ab und erlaubt es ihnen somit eine spezifische ökologische Nische im Pansen zu besetzen. Zusammenfassend konnte diese Arbeit zeigen, dass Methanoplasmatales in Mooren und tierischen Verdauungstrakten sehr weit verbreitet sind, und zumindest im Rinder-Pansen zu den abundantesten Methanogenen gehören. Demnach spielen sie weltweit eine wichtige Rolle als CH4 Produzenten, was sie in Bezug auf Strategien zur Verringerung der CH4 Emissionen zu einer besonders interessanten Organismengruppe macht. Weiter Studien, insbesondere kultivierungs-unabhängige Studien, sind nötig um mehr über die (Öko)-Physiologie und die Interaktionen der Pansen-Mp zu erfahren und dadurch brauchbare und umsetzbare Strategien zur Senkung der globalen CH4 Emissionen entwickeln zu können. Methane (CH4), a very potent greenhouse gas, is mainly produced biotically by methanogenic archaea as an end-product of their anaerobic respiration. Wetlands and ruminants are the major natural and anthropogenic CH4 sources, respectively. Recently a novel, previously unrecognised, 7th order of methanogenic archaea, within the class of Thermoplasmata, was proposed - the Methanoplasmatales (Mp). Until now, only one Mp isolate could be obtained (from human feces), producing CH4 from methanol (MetOH) and hydrogen (H2). Furthermore, a metatranscriptomic study provided compelling evidence that rumen Mp reduce methylamines to CH4. The main objectives of this work were (I) the investigation of the environmental distribution of Mp and (II) their cultivation from bovine rumen as basis for physiological and genomic characterisations. Different wetland types (acidic/neutral; temperate/arctic) and feces of various animal species were screened for Methanoplasmatales with PCR by targeting two established phylogenetic marker genes: 16S rRNA and mcrA (encoding Methyl:Coenzmye M reductase, the key enzyme of methanogenesis). More than 42 PCR products were cloned, >240 clones sequenced, and phylogenetic trees were constructed. Mp 16S rRNA genes were detected in all temperate and arctic wetlands as well as in most investigated animal feces (elephant, cow, rat and tortoises). In all animals and in several wetlands mcrA genes affiliated with Mp were also detected. Phylogenetic analyses of both genes showed that the obtained sequences formed two distinct clusters; one dominated by animal sequences (animal cluster) and the other by wetland sequences (wetland cluster). The occurrence of two distinct Mp sequence clusters point to Mp ecotypes with special adaptations to their environment (endosymbiotic vs. free-living). However, further studies on abundances and activity of Mp in wetlands are necessary to assess their role in CH4 formation in these environments. For rumen enrichment cultures Mp medium was inoculated with bovine rumen fluid and incubated either with trimethylamine (TMA) or MetOH. Mp abundances and enrichments of subcultures were monitored via qPCR. Physiological tests, different procedures to increase Mp enrichments and metagenomic studies were performed on different stages of enrichment cultures. Initially, the microbiota of bovine rumen fluid consisted of less than 1 % Methanoplasmatales, nevertheless comprising about 40 % of all rumen methanogens. Sequencing showed that all Mp belonged to the animal cluster. The Mp could be enriched both with TMA (up to 34 % of prokaryotic community) and with MetOH (up to 52 %). Under both conditions more than 99 % of the methanogens consisted of Mp. Considerable Mp growth was only observed if cultures were supplemented with sterile filtered rumen fluid and H2. Whenever bacteria were inhibited, no considerable Mp growth was observed. Metagenomic analyses showed that the Mp and the bacterial community composition changed during the enrichment trials; after 13 transfers the Mp community was dominated by wetland cluster Mp (69 %). Two partial rumen Mp genomes (about 80 % completeness) could be obtained from a metagenome; one related to Candidatus Methanomethylophilus alvus (animal cluster Mp) the other to Methanomassiliicoccus luminyensis (wetland cluster Mp). Genes for methanogenesis from methylated compounds (MetOH, methylamines and dimethyl sulfide) were found in the genomes of M. luminyensis and Ca. M. alvus as well as in the two partial rumen Mp genomes. However, both partial rumen Mp genomes lack genes necessary for the reduction of TMA to CH4. The loss of TMA utilization during the enrichment trials was also indicated by the loss of mttB (trimethylamine:corrinoid methyltransferase) genes (negative PCR amplification) and TMA measurements. Acetate was identified as possible carbon source for Mp due to the presence of acetyl-coenzym A synthetase and pyruvate:ferredoxin oxidoreductase genes in the partial genomes and the genomes of M. luminyensis and Ca. M. alvus. It is very likely that endosymbiotic Mp, like rumen Mp, live in close metabolic interactions (e.g. syntrophy) with other intestinal microorganisms, as indicated by the enrichment trials, which revealed a link between rumen Mp and rumen bacterial growth and a dependency of Mp growth on supplementation with sterile rumen fluid possibly containing specific metabolites essential for Mp. Rumen Mp utilizing methylamines seem to occupy a unique metabolic niche in the bovine rumen. The only other methanogenic group known to possess this metabolic capacity (Methanosarcinales) is usually not found in ruminants. According to these results, Methanoplasmatales are widely distributed in wetlands and animal intestinal tracts and are one major methanogenic group in the bovine rumen, suggesting that Mp play an important role in global CH4 formation. This makes them a potentially important target for CH4 mitigation strategies, especially in ruminants. Rumen Mp appear to be H2-dependent methylotrophic methanogens with a wide range of methylated compounds as electron acceptors and acetate as C source. To gain more and better knowledge on the eco-physiology and interactions of rumen Methanoplasmatales further studies and especially cultivation-independent approaches are necessary, as cultivation biases emerged during the enrichment attempts.