Recombinant human single chain antibodies against inhalative and food allergens using phage display - Ackerbauer, Daniela (2012)
Die Vertreter der β-Parvalbumin Proteinfamilie, zu denen auch das Allergen Gad m 1 aus Kabeljau zählt, sind verantwortlich für 95% der berichteten Fälle von Fischallergie. Die strukturelle und immunologische Charakterisierung von Allergen ist grundlegend für ein besseres Verständnis der hohen Kreuzreaktivität von Fischarten. Daher wurde im Zuge dieser Arbeit isotopenmarkiertes rGad m 1 exprimiert und aufgereinigt für spätere Strukturbestimmung mittels NMR-Spektroskopie. Außerdem soll das Epitop des Gad m 1 spezifischen scFv-K/F9 Antikörper mit NMR-Spektroskopie bestimmt werden, da dieser die Bindung von sIgE aus Seren fischallergischer Patienten an Gad m 1 um bis zu 80% inhibieren konnte. Der scFv-K/F9 Antikörper wurde in E. coli HB2151 exprimiert und aus dem Periplasma extrahiert. Der Antikörper konnte dank His6-Tag mittels Nickel-Affinitätschromatographie aufgereinigt werden. Aus einem Liter bakterieller Kultur konnte ein Ertrag von 1 mg reinem scFv-K/F9 erzielt werden. Die Spezifität des Antikörpers wurde in einem Western Blot überprüft, wo er in einem Kabeljau Gesamtproteinextrakt spezifisch an Gad m 1 band. Das Allergen rGad m 1 wurde in E. coli BL21(DE3) exprimiert, indem die bakterielle Kultur in 13C und 15N markiertem Medium gezüchtet wurde. Nach Zelllyse mittels French Pressure Cell Press und PEG Proteinfällung wurde das Allergen durch aufeinanderfolgende Anionentauscher- und Gelfiltrations-Chromatographie aufgereinigt. Das Protein wurde als 12 kDa Bande in 15% SDS-PAGE und anti-Frosch Parvalbumin Western Blot nachgewiesen. Aus 3 L bakterieller Kultur konnten 4 mg reines isotopenmarkiertes rGad m 1 gewonnen werden. Die Spezifität des scFv-K/F9 Antikörpers für isotopenmarkiertes rGad m 1 wurde in ELISA getestet. Die Bindungskapazität des Antikörpers für rGad m 1 in der Abwesenheit von Ca2+war um 75% reduziert verglichen mit der für nGad m 1 und fast null in der Anwesenheit von Ca2+. Die Ursache für diese Beobachtung konnte in dieser Studie nicht ermittelt werden. Antikörper im scFv Format sind die kleinsten Antikörperfragmente, die über eine vollständige Antigenbindungsstelle verfügen und sich daher besonders für Epitopbestimmungen an der Oberfläche von Allergenen eignen. Die Kenntnis über konformationelle IgE Epitope ist grundlegend für das Verständnis der Kreuzreaktivität von Bet v 1, dem Hauptallergen aus Birkenpollen, und seinen Homologen aus pflanzlichen Nahrungsmittel. Aus diesem Grund wurde die ETH-2 Phagenbibliothek verwendet, um monoklonale scFv Antikörper spezifisch für Bet v 1 und seine Homologen aus Apfel (Mal d 1) und Sellerie (Api g 1) zu isolieren. Die Spezifität der isolierten Phagenklone nach unterschiedlichen panning-Runden wurde in direkten ELISA Versuchen getestet. Phagenklone, die an Api g 1 banden, waren am Seltensten, während kreuzreaktive Klone mit Bet v 1 und Mal d 1 genauso wie Klone, die ausschließlich Bet v 1 erkannten, einfach zu isolieren waren. Die Spezifität für Bet v 1 war am Höchsten, wenn drei panning-Runden gegen das Hauptallergen aus Birke selbst durchgeführt wurden. In diesem Fall waren 42% der getesteten Klone höchst spezifisch für Bet v 1. Klone, die ausschließlich Bet v 1 erkannten, wurden für Epitopbestimmungen in ELISA Versuchen mit Hilfe von vier chimären Proteinen aus Bet v 1 und Api g 1 auserwählt. Die Klone B/B/B 2 und B/B/B 08 wiesen hohe Bindungskapazität für Bet v 1 und Api-Bet-3 auf, sodass ihr Epitop auf die C-terminale Region von Bet v 1 lokalisiert werden konnte. Das Epitop des Klons B/M 10 hingegen konnte aufgrund seiner Spezifität für Bet v 1 und Api-Bet-4 auf die C-terminale Helix von Bet v 1 lokalisiert werden. Die Sequenzierung der Phagen-DNA zeigte, dass die Klone B/B/B 2 und B/B/B 08 zu 100% ident waren. Die löslichen scFv Antikörper wurden in E. coli HB2151 exprimiert, aus dem Periplasma extrahiert und nach einem mehrstufigen Aufreinigungsprozess für ELISA Inhbitionsversuche verwendet. Der scFv-B/B/B 2 Antikörper war in der Lage die Bindung von sIgE aus Seren von 12 Birkenpollenallergikern auf Bet v 1 um 12-50% zu inhibieren. Der scFv-B/M 10 Antikörper hingegen konnte nicht mit sIgE um die Bindung zu Bet v 1 konkurrieren. Das Zusammenführen der Ergebnisse aus den Epitopbestimmungen und jenen aus den ELISA Inhibitionsversuchen führte zu der Schlussfolgerung, dass es sich bei der C-terminalen Region von Bet v 1 um ein bedeutendes IgE Epitop handelt. The allergen Gad m 1 from Atlantic cod belongs to the family of β-parvalbumins which are responsible for 95% of reported cases of fish allergy. The structural and immunological characterisation of allergens is essential for the investigation of cross-reactivity between fish species. We therefore aimed to express and purify isotope-labelled rGad m 1 for structure determination by NMR spectroscopy. Furthermore, we aimed to map the epitope of the previously isolated scFv-K/F9 antibody specific for Gad m 1 and able to inhibit sIgE binding to Gad m 1 in sera of fish allergic patients up to 80%. The scFv-K/F9 antibody was expressed in E. coli HB2151 and extracted from the periplasm. The antibody was purified by nickel-based affinity chromatography due to its His6 tag. A total of 1 mg purified scFv-K/F9 was obtained from one litre of bacterial culture. The antibody’s ability to recognise Gad m 1 in a total protein extract of Atlantic cod was verified by Western blotting. The allergen rGad m 1 was expressed in E. coli BL21(DE3) by growing the bacterial culture in 13C and 15N labelled medium. After cell lysis by French Pressure Cell Press and PEG protein precipitation the allergen was purified by consecutive anion exchange and gel filtration chromatography. The protein was identified as a single 12 kDa band by 15% SDS-PAGE and anti-frog parvalbumin Western blot. Expression in 3 L bacterial culture resulted in 4 mg pure isotope-labelled rGad m 1. The specificity of scFv-K/F9 for isotope-labelled rGad m 1 was tested in ELISA. The binding capacity of the scFv antibody was reduced by 75% in the absence of calcium compared to nGad m 1 and next to nought in the presence of Ca2+. A causal explanation for this observation could not be found by this assay. Antibodies in the scFv format are the smallest antibody fragments providing the complete antigen binding site and are a useful tool for epitope mapping on the surface of allergens. Information about conformational IgE epitopes is crucial for the understanding of cross-reactivity between the major birch pollen allergen Bet v 1 and its homologues in plant foods. For this purpose, the ETH-2 phage display library was used to isolate monoclonal scFv antibodies specific for Bet v 1 and its homologues in apple, Mal d 1, and in celery, Api g 1. After sequential antigen panning, the specificity of isolated phage clones was investigated in ELISA. Phage clones binding to Api g 1 were less abundant whereas cross-reactive clones between Bet v 1 and Mal d 1 and clones exclusively binding to Bet v 1 were easy to isolate. The highest specificity for Bet v 1 was obtained when panning three times against the major birch pollen allergen, where 42% of the isolated clones were able to recognise Bet v 1. Clones exclusively binding to Bet v 1 were selected for epitope mapping with the use of four chimeric proteins of Bet v 1 and Api g 1. The two clones B/B/B 2 and B/B/B 08 strongly recognised Bet v 1 and the Api-Bet-3 chimer, locating their epitope to the C-terminal region of Bet v 1. The epitope of the clone B/M 10, which bound to Api-Bet- 4, was found to be in the C-terminal α-helix of Bet v 1. Sequencing of the clones revealed 100% identity between B/B/B 2 and B/B/B 08. After soluble expression of the scFv antibodies in E. coli HB2151, periplasmic extraction and a multi-step purification, the antibodies were used in sIgE inhibition ELISA. The scFv-B/B/B 2 was able to inhibit sIgE binding to Bet v 1 in sera of 12 birch pollen allergic patients by 12% to 50% whereas the scFv-B/M 10 was not able to inhibit sIgE binding in any of the patients’ sera. The combination of epitope mapping and sIgE inhibition ELISA defined the C-terminal region of Bet v 1 as a highly relevant IgE epitope.