Apoptosi e HSP70 come marcatori di adattamento ambientale nei pesci telostei - Ceccarelli, Giuseppina (Università degli studi della Tuscia - Viterbo, 2009)
Dottorato di ricerca in Evoluzione biologica e biochimica La spigola (Dicentrarchus labrax) è un Teleosteo marino allevato intensivamente in tutta l’area del Mediterraneo sia in gabbie immerse che in stabilimenti a terra. Il mantenimento di un ottimale stato di salute durante l'allevamento rappresenta quindi un passo cruciale per migliorare la produttività e per evitare dannose perdite animali o inquinamenti da farmaci somministrati a scopo profilattico. I principali fattori in grado di influire negativamente sullo stato di salute delle specie allevate sono le avverse caratteristiche dell’acqua (temperatura, basse concentrazioni di ossigeno, elevate concentrazioni di anidride carbonica e ammoniaca) e un’impropria gestione delle condizioni di allevamento (manipolazione, densità, trasporto, alimentazione). Tali condizioni hanno come conseguenza lo stabilirsi di situazioni ad alto stress. In questo lavoro sono stati presi in esame due meccanismi fisiologici di adattamento a fattori di stress (naturale e indotto) in acquacoltura: il processo di apoptosi e l’espressione di una delle proteine dello shock termico, l’HSP70, allo scopo di ottenere degli indicatori di stress/adattamento in specie di pesci Teleostei che possano essere utilizzati sia in allevamento sia per il monitoraggio ambientale. Inizialmente, è stato effettuato uno studio comparativo sulla presenza di cellule apoptotiche intratimiche (tecnica della marcatura terminale in situ del DNA frammentato) durante lo sviluppo e in età tardo-giovanile in specie di acque temperate (spigola, carpa, cernia). Il timo di tali specie è stato poi comparato con quello di specie polari, allo scopo di valutare la localizzazione di possibili processi di selezione nel timo di diverse specie di Teleostei e ottenere così una conoscenza del ruolo dell'apoptosi nel naturale processo di maturazione di questo organo e in condizioni di adattamento a temperature estreme. Il timo dei pesci svolge un ruolo importante nello sviluppo del sistema immunitario, in particolare nello sviluppo e nel differenziamento dei linfociti T. Nella carpa (Cyprinus carpio), sono stati confermati i dati già esistenti durante lo sviluppo (Romano et al., 1999b) ed in seguito sono stati ulteriormente ampliati. Durante la 1° settimana post schiusa (p.s.), 3 giorni dopo la comparsa dell’abbozzo timico, si evidenziano diffuse cellule apoptotiche nel parenchima. Dalla 1° alla 4° settimana p.s. il numero di queste cellule aumenta, e risultano essere localizzate principalmente nella regione più esterna del timo. Dalla 22° settimana p.s. in poi le cellule apoptotiche diventano molto più numerose nel cortex che nella medulla e si comincia ad osservare un leggero aumento della densità di queste cellule al confine cortico-medullare. Nelle specie tardo giovanili il numero delle cellule apoptotiche diminuisce, e rimangono confinate preferenzialmente nel cortex. Nei pesci Teleostei Perciformi la distribuzione delle cellule apoptotiche è risultata simile a quella della carpa: i) nella spigola (D. labrax), in accordo con precedenti studi (Abelli et al., 1998), le prime cellule apoptotiche compaiono intorno al 35° giorno p.s.; ulteriori analisi hanno indicato un particolare ruolo delle regioni corticali e cortico-medullari. Infatti durante lo sviluppo le cellule apoptotiche dalla porzione più esterna del timo si localizzano anche più centralmente, nel bordo cortico-medullare (a 70 giorni p.s.) e raramente nella medulla. Dal 165° giorno p.s. e nei pesci tardo-giovanili, il numero delle cellule apoptotiche diminuisce nel bordo cortico-medullare e rimane confinato prevalentemente nel cortex; ii) nella cernia (Epinephelus marginatus) le cellule apoptotiche cominciano ad apparire 48° giorno p.s. Durante tutto lo sviluppo del timo si osserva un incremento del numero di tali cellule soprattutto nel cortex e nel bordo cortico-medullare. Negli individui giovanili e tardo-giovanili le apoptosi rimangono più numerose nella regione corticale; iii) nei pesci antartici (timo adulto), dove il timo è estremamente adattato alle basse temperature (elevata vascolarizzazione e stroma fortemente compattato) le apoptosi sono molto più numerose (4-7 volte) rispetto a quelle delle specie di acque temperate e risultano distribuite principalmente nel cortex. Nell’insieme questi dati suggeriscono che nel timo ci sia un comune processo di selezione negativa durante l’ontogenesi, tale processo risulta principalmente ristretto al cortex e al bordo cortico-medullare. Anche nel pesce adulto il processo di selezione sembra essere attivo, ma confinato principalmente nella regione corticale. Successivamente è stato effettuato uno studio sull’effetto dello stress termico nella spigola, una specie che presenta capacità di adattamento a variazioni di temperatura dell'acqua. La temperatura rientra tra i principali parametri ambientali in grado di influire sulla qualità dell’acqua e sullo stato di benessere delle specie allevate, e può quindi essere considerata una possibile fonte di stress. Nel presente lavoro è stato studiato in larve di spigola (47-70 giorni post-schiusa, p.s.) l’effetto dell’aumento della temperatura (4 gradi) sull’induzione di apoptosi(marcatura terminale in situ del DNA frammentato) e sulla sintesi della proteina di shock termico, l’Hsp70. Le larve sperimentali sono state sottoposte al 50° giorno p.s e campionate dopo 40 minuti, 2 ore e 24 ore di stress, inoltre sono stati prelevati campioni anche a 10 e 20 giorni dal termine del trattamento. Negli esemplari di controllo le cellule apoptotiche aumentano progressivamente durante lo sviluppo nelle branchie e nel timo, in particolare in quest’ultimo risultano essere localizzate nel cortex e soprattutto nel bordo cortico-medullare. Negli esemplari stressati si osserva un aumento significativo dell’apoptosi nel timo e nel rene, rispetto al controllo, già dopo 40 minuti di stress termico (rispettivamente P<0,001 e P<0,05),tuttavia questi valori tendono ad essere comparabili a partire dalle 2-24 ore successive posttrattamento. Nelle branchie il picco apoptotico, con differenze statisticamente significative rispetto al controllo (P<0,05) si raggiunge dopo 2 di stress con cellule distribuite in modo uniforme nella mucosa. L’espressione citoplasmatica dell'HSP70 è costitutivamente presente nei campioni di controllo esaminati, ed un aumento dell'intensità è valutabile sia a livello immunoistochimico che mediante la tecnica ELISA. Nel timo e nelle branchie tale induzione si verifica subito dopo i primi 40 minuti di stress, nel rene invece dopo 2 ore di stress. Tale aumento di espressione rimane costante fino al 20° giorno dal termine del trattamento per il timo e le branchie mentre tende ad una diminuzione progressiva nel rene. I risultati di questo studio hanno quindi dimostrato che sia l’apoptosi che l’espressione dell’HSP70 possono essere utilizzati come efficienti indicatori di stress termico nella spigola. Infine è stato svolto uno studio complesso che ha avuto lo scopo di valutare l’efficacia di cicli vaccinali sul sistema immunitario specifico e non specifico in giovanili di spigola. Accanto alla valutazione dell'efficacia di vaccinazione, nuove strategie vaccinali sono richieste dal settore dell’acquacoltura, poichè le direttive dell’Unione Europea (2006), limitando l’uso di antibiotici in coltura, spingono l'allevatore a diminuire l’utilizzo di chemioterapici a scopo profilattico. In questo studio, avannotti di spigola sono stati sottoposti ad innovativi cicli di vaccinazione contro Vibrio anguillarum (ciclo completo: due vaccinazioni per bagno ed una iniezione per i.p.; ciclo incompleto: solo due vaccinazioni per bagno), dal 95° giorni p.s. al 291°giorno p.s., al fine di controllare la risposta immunitaria (specifica e non specifica) alla vaccinazione stessa. Parallelamente è stato analizzato il processo di induzione apoptotica e l’espressione dell’HSP70, negli organi immunitari più superficiali e quindi maggiormente esposti alla vaccinazione per bagno (timo, branchie e rene cefalico). In particolare, per quanto riguarda l’immunità specifica, si è osservato un aumento di linfociti B nel rene cefalico e milza, dei livelli sierici di Ig specifiche anti-Vibrio, ed un aumento della capacità di agglutinazione del batterio negli individui vaccinanti con il ciclo completo. Analogamente anche il sistema immunitario non specifico ha evidenziato un aumento dell’attività di burst ossidativo nei leucociti purificati di rene cefalico e milza dei soggetti vaccinati. L’analisi del processo apoptotico e l’espressione proteica della heat shock protein 70 (Hsp70) ha dimostrato che, dal 95° al 291 ° giorno, la diminuzione delle cellule apoptotiche, nonché l’espressione delle HSP70, che si evidenziano sono da attribuirsi ad una normale attività di differenziamento degli organi e che solo nel timo l’espressione dell’HSP70 sembra invece essere dovuta al ciclo vaccinale. Dai risultati di questo studio emerge quindi che i possibili indicatori in grado di poter rivelare l’efficacia della risposta immunitaria indotta dalla vaccinazione potrebbero essere l’efficienza di agglutinazione batterica, l’espressione timica delle HSP70 (sistema immunitario specifico) e la produzione di ROS (sistema immunitario non specifico). The worldwide decline of fisheries stocks has provided a rapid growth in fish farming and a growing economical interest in intensive aquaculture, thus gained great importance to plan a proper management in order to limit stressful stocking conditions and environmental impact. This management should improve fish welfare and counteract adverse water characteristics. In aquaculture fish are exposed to stressful conditions that can be due to routine procedures (handling, selection, weighing), management factors (high stocking density, feeding, temperature and water quality or disease), transport conditions and slaughter procedures. Direct parameters such as haematocrit, total haemoglobin, blood glucose and hydrocortisone, frequently reported as descriptors of the fish conditions, may be not sufficiently reliable when chronic stresses are applied. It is therefore necessary to search for further parameters, such as alternative markers, capable to describe fish welfare to keep under control fishes in aquaculture. In this thesis work it was examined two different parameters: apoptotic process and the expression of one of the Heat Shock Protein (HSP70), to the aim of use these as markers of stress in fish farming and possibly in environmental monitoring. With this aim, the study in the beginning analysing the physiological apoptosis presence in developmental thymus and in the late-juveniles/adult of fresh/marine temperate water species (Dicentrarchus labrax, Epinephelus marginatus, Cyprinus carpio), and after that in species adapted to polar water (- 1°C) such as the Trematomus species. The fish thymus plays an important role in the development of a fully functional immune system in maturing lymphocytes (T) where the selection process of autoreactive/damaged cells plays a central role. The developmental results showed that probably in Cypriniformes and Percyformes this selection process can be occur with similar features in thymus, and that it is mainly restricted to cortical/medullary border and cortex. Particularly, in carp, it was confirm and amplified previous studies (Romano et al., 1999b). The cells appeared scattered in the parenchyma in the first week post hatch (ph). From the first to the 4th week ph, the number of apoptotic cells increased in the outer-cortical region of the thymus. From the week 4 until 30-40 weeks post hatch (ph) the mean diameter of non-apoptotic lymphoid cells varied following the formation of cortex and medulla. At 22 untill 48-50 weeks ph apoptotic cells were more numerous in the cortex and cortical/medullary border than in the medulla. From 22 months ph onwards the apoptotic cells remains confined minly in the cortex. In Perciformes Teleosts the distribution was evidenced like in carp: i) In sea bass, it was confirmed the observations done in previous studies (Abelli et al., 1998) and further analysis revealed a cortical and cortical/medullary border distribution of apopotic cells from 70 days ph until 165 days ph. ii) in Epinephelus marginatus the first anlagen of lymphoid thymus appears at day 15, while apoptotic cells were evidenced at day 48 ph. During thymus development the number of apoptotic cell increased in cortex and, contemporary decreased the average of diameter of the counted elements. In late juveniles/adult (9 months ph onwards), the apoptotic cells were mainly restricted in the cortex similarly to other species. iii) In adult Antarctic Perciformes the thymus is extremely adapted to low temperature (high vascularisation and strongly compact stroma) and. the apoptosis was 4-7 fold more intense than in temperate water fish and mainly distributed in the cortex. Although gradually temperature changing may be physiologically balanced, rapid changes, as occur in land aquaculture, can disturb homeostasis acting as a stressor. Subsequently it was analysed the effects of the thermic stress on the European sea bass (Dicentrarchus labrax), a largely reared fish species in offshore cages and in land aquaculture. Although gradually temperature changing may be physiologically balanced, rapid changes disturb homeostasis acting as a stressor. With this aim it was studied the effect of temperature enhance (+ 4°C) on most superficial lymphoid organs (thymus, head kidney and gills) of larva (47-70 days p.h.) by using as markers of stress: the apoptotic process (by in situ end-labelling of fragmented DNA) and the expression of HSP70. The temperature of experimental group of larvae have been raised at 50th days for two hours, and the stressed individuals are sampled after 40 minutes, 2 hours, 24 hours and 10 days and 20 days post-treatment. In control, the gills and thymus the number of apoptotic cells progressively growth following the develop of the organs. In the stressed larvae, 40 minutes after stress, the apoptotic processes peaked significantly in thymus (P<0,001) and head kidney (P< 0,05), while in gills (P<0,05) the peak was delayed at 2 hours after stress. At 10 and 20 days post-treatment the apoptosis number decreased and was comparable to control levels. The expression of HSP70 was detectable with the ELISA assay and immuno-histochemistry techniques. In non-treated larvae, HSP70 was constitutively expressed whereas in stressed larvae, significantly enhance of the expression was revealed at 24 hours after stress, in thymus (P<0,01) and head kidney (P<0,01). In gills, HSP70 was more expressed at 10 days after stress (P<0,05). In all organs the expression level of HSP70 remained high as compare to control samples. Taken together, this study suggest that apoptosis and HSP70 as potential candidates to describe the fish welfare. In respect with the new European directives (2006), new vaccine therapies are requested by fish farming to prevent various infectious disease and contemporary maintaining the welfare of fish and the integrity of environment. In this work we evaluate the efficiency of different vaccination trials, against Vibrio anguillarum, on the specific and non-specific immune system of juveniles sea bass. In parallel it was inquired the eventual induction of apoptosis and expression of HSP70 in thymus, gills and head kidney. From the 95th days p.h. the larvae were submitted to two trials: a) two vaccinations for immersion (95 and 165 day ph) or b) two vaccinations for immersion (95/165 days ph) followed to a intraperitoneal injection (233 day ph). The specific immunity activation was demonstrated in vaccinated group by the significative enhance of B lymphocytes in the head kidney and spleen, contemporary to intensification of specific anti-Vibrio Ig serum content, and the agglutination capacity of the bacteria. Non-specific immunity activation was contemporary demonstrated by the enhancement of the respiratory burst in leucocytes of head kidney and spleen. The Respiratory Burst test (by ROS test) on phagocytes (macrophages and granulocytes) of nontreated and experimental groups, evidenced in the latter groups a enhance of phagocytic capability already after two vaccination for immersion. A decrease of the apoptotic processes was revealed in thymus, head kidney and gills during the trials in both experimrntal and nontreated groups. Morover, also the expression of HSP70 in organs showed a similar trend. Probably, it was due to a normal differentiation mechanism of the organ. Interestingly, in thymus of the experimental groups the HSP70 had a significant enhance of expression in cortical and cortical/medullary border cells as compare with control group (P<0,01). These data demonstrates that the agglutination test, ROS test and HSP70 expression are possible markers for the efficiency of the vaccination therapy. Morover, vaccinations early done by immersion (90 days followed by an other one 60-70 days later) can be sufficient to protect sea bass juveniles by V. anguillarum infection.