Epidemiological Importance of Rodents as Reservoirs of Leptospira in Maronesa Cattle Farms in Trás-os-Montes Region

• Main Author: Cardoso, Maria das Neves Mitelo Morão de Paiva
• Other Authors: Pereira, Margarida Maria Ivens Colares, Rodrigues, Jorge de Almeida
• Format: Doctoral or Postdoctoral Thesis
• Language: English
• Published: 2009
• Subjects: Bovinae; Leptospirose; Leptospira; Região de Trás-os-Montes (Portugal); Raça maronesa; Epidemiologia molecular e serologia; 636.2.09(469.2)(043); 616.98(469.2)(043); 579.62(469.2)(043); Elevado; Pomona; Rattus rattus
• Online Access: http://hdl.handle.net/10348/2639

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias Leptospirosis is a zoonosis caused by pathogenic spirochetes of genus Leptospira, maintained in nature by numerous reservoirs, free-living and domestic animals, constituting a potential source of infection for humans, and other susceptible hosts (Turner, 1967; Little, 1986). Leptospirosis is considered by O.I.E. (2008) as a disease of importance to international trade, and it is included in the list of “Multiple species diseases.” Leptospirosis is also regarded as a re-emerging zoonosis (Higgins, 2004). The emergence of several zoonoses seems related to a combination of factors namely: the global warming, expanding human populations, globalisation of trade, intensification of wildlife farming, and microorganisms associated to wildlife incoming intensive livestock production systems (Bengis et al., 2004). Indeed, leptospirosis causes a decrease in the income of cattle farms, mainly due to its impact on the reproduction programs. Financial damages of considerable economic loss, through reproductive wastage due to chronic infection with Hardjo serovar (Sejroe serogroup), result mainly from infertility, abortion in the last months of gestation, premature births, death of calves of 15-60 days, death of adult animals, decrease of the milk and meat productions, and rejection of bulls for artificial insemination (Ellis, 1994). Rodents, the major renal carriers of Leptospira, assume a very important role on disease transmission to man and animals (Little, 1986). Previous studies on the role of wildlife leptospirosis in Portugal have been conducted in the south and central mainland Portugal and in the archipelago of Azores by Collares-Pereira et al. (2000a), but not in the north. However, the last serological survey, in cattle (n=1,433), carried out at a national level (Paiva-Cardoso et al., 2000) found the high seropositivity rates in the northern regions, namely Trás-os-Montes (66.3%), Beira Litoral (53.3%) and Entre-Douro e Minho (39,7%), though the important percentage observed in the south, in Alentejo (75.9%) and Ribatejo e Oeste (36.8%) regions. In addition, the occurrence of different agglutination patterns in the bovines studied when compared to cattle from other regions of Portugal would be reported in further studies (Paiva-Cardoso, 2000; Paiva-Cardoso et al., 2001). The main objective of the present research was to contribute to the knowledge of bovine leptospirosis in the north of Portugal, particularly in Trás-os-Montes, region where indigenous Maronesa cattle is bred under traditional management systems. Nowadays, the main income source from the production of this breed is the production of calves for beef consumption, due to the high quality of their meat; thus, the maintenance of high reproductive levels is essential, within a strategy of preservation of this indigenous breed, based on measures beyond the genetic improvement, that allow a viable economic production without loosing the high standard for meat quality. Given that, the present research attempted for the first time the isolation of pathogenic strains from local small mammals, in view of a more specific contribution to the pioneer research about the role of these renal Leptospira chronic carriers, in Maronesa breeding smallholdings. A total of 308 small mammals, mainly rodents, were trapped on cattle smallholdings of Trás-os-Montes region, with the following distribution: Mus musculus (n=255), M. spretus (n=24), Rattus norvegicus (n=19), R. rattus (n=3), Apodemus sylvaticus (n=4) and Crocidura russula (n=3) (Paiva-Cardoso et al., 2005a). Seventeen rodent-isolates were obtained by culture in selective media as follows: 13 strains from Mus musculus, three from Mus spretus and one from Rattus norvegicus. Of these, only 14 strains were forwarded for identification by microscopic agglutination test (MAT), monoclonal antibodies and restriction endonuclease analyses, being further used in the reference MAT under the small mammals and cattle serosurveys. Eleven strains have been identified as belonging to Ballum serogroup (serovar Ballum), one to Sejroe group (serovar Saxkoebing) and the remaining two strains to Pomona group (serovar Kunming?). This latest isolated-serovar is still unknown in Portugal (Paiva-Cardoso et al., 2005a) and showed reactivity profiles very different from those obtained with Mozdok and Tsaratsovo strains previously isolated in Portugal (Collares-Pereira et al., 1996, 1997a, 1997b, 2000a, 2000b; Rocha, 1990; Rocha, 2004). Once the most closely related serovar to these Pomona isolated-strains has only been found in China (Zhang et al., 1987; Brenner et al., 1999; Salaün et al., 2006), there is a distinct possibility that these isolates represent a new serovar, whose clinical meaning to cattle health needs further evaluation. Regarding Sejroe serogroup, the isolation of a serovar (Saxkoebing) from the house-mouse Mus musculus is a very important epidemiological finding, not only because it‟s the first report in Portugal, but also in the Iberian Peninsula (Paiva-Cardoso et al., 2005a). To overcome the reduced information gathered by culturing, for the renal carrier state evaluation of the small mammals analysed, a polymerase chain reaction (PCR) was performed on 278 (90.3%) kidney samples, using three pairs of primers: G1/G2 derived from the sequence of the recombinant plasmid pLIPs60; a primer set designed from LipL21 gene sequence and a Southern Blotting using a 257 bp probe; and a primer set designed from LipL32 gene sequence with a 423 bp probe in the Southern Blotting. Leptospiral DNA was detected in 54% (150+/278) of the small mammals examined, that is, near 10 times greater than the percentage of 5.5 % (17+/308) obtained by culture. These bacteriological data confirm the generalized occurrence of Leptospira infection in the rodents‟ population studied, and anticipate the increased importance of these vertebrates in the transmission of leptospires to cattle, especially concerning accidental infections (Paiva-Cardoso et al., 2005b). Two hundred and eighty two sera from small mammals (91.6%) were tested by the microscopic agglutination test. The seroreactivity rate (55%) was similar to that found in the molecular approach for the search of leptospiral DNA, meaning that a spirochete infection took place in a recent past. The use of local isolated field-strains, as MAT live-antigens, contributed to increase the diagnostic value of this laboratory approach in animals with a potentially reduced immune response due to their chronic renal carrier condition of these leptospires. In parallel, the study of anti-Leptospira seroreactivity in cattle, aiming at the indirect evaluation of the occurrence of accidental infections by murine transmitted leptospires, evidenced a high (61.0%) percentage of reactive animals at low titres, equal or higher than 1: 10 (geometric mean titre 1:17). As expected, the anti-Sejroe titres were the most common, representing 26.7% of the agglutinations detected. This finding may not only be due to the high number of bovines with an anti-Hardjo response, as an endemic cattle infection, but also to the contact with serovar Saxkoebing isolated from the house-mice Mus musculus present in the same ecosystem. The seroreactivity of 12.1% with Ballum serogroup was also important, suggesting that exposure of cattle to rodent maintained-serovars of this serogroup is high in this region. Serogroup Pomona registered a serological prevalence of 11.8%, which was compatible with the existence of incidental infections with its serovars, namely serovar Kunming (?) firstly isolated in Portugal. Similarly to rodents, the greatest immunogenicity of the antigens (isolates) used in MAT, certainly contributed to the important detection of specific agglutinins in the cattle surveyed. The intensive management systems for bovines have shown to be an increased risk for the greater contact with infected rodents, especially Mus musculus, the most trapped animal species and the one with a higher number of isolates obtained. However, Leptospira transmission risk by other species was also high, due to the strong seropositivity detected in Rattus rattus (100%), Apodemus sylvaticus (75%), Mus spretus (56.5%) and Rattus norvegicus (55.7%). These findings assess the need for an effective control of rodents in the smallholdings studied, due to the wide inexistence of cattle protective measures, in particular, in Bragança district, where the presence of anti-Leptospira agglutinins was significantly higher (p<0.0001) than the one for Vila Real district. Amongst the pointed reasons to justify this observation, genetic factors of the breed (Mirandesa) with a higher density in that geographical area are admitted, but other eco-epidemiological studies are needed to explain the differences observed. On the contrary, Maronesa showed to be less sensitive to leptospirosis than the remaining non-Maronesa breeds, being genetic factors together with the type of cattle management also suggested as potential reasons to explain this feature. In conclusion, Leptospira infection is widely spread in rodents of Trás-os-Montes region and the percentage of renal chronic carriers is sufficiently important to increase awareness regarding cattle production of indigenous breeds, including Maronesa, though its (apparent) higher resistance to disease. Thus, there is an urgent need towards the implementation of surveillance and control measures of leptospirosis, in order to reduce both the consequences for human and animal health, besides the inherent social and economic effects in this Northern Portuguese region. A leptospirose é uma zoonose causada por espiroquetas patogénicas do género Leptospira, mantidas na natureza por numerosos reservatórios selvagens e domésticos, que constituem uma fonte potencial de infecção para humanos e outros hospedeiros susceptíveis (Turner, 1967; Little, 1986). A leptospirose é considerada pela O.I.E. (2008) uma doença de importância para o comércio internacional e encontra-se incluída na lista das “doenças que afectam múltiplas espécies”. A leptospirose é igualmente uma zoonose reemergente (Higgins, 2004). A emergência de várias zoonoses parece relacionada com a combinação de alguns factores, tais como: o aquecimento global, a expansão das populações humanas, a globalização do comércio, a intensificação da produção de espécies selvagens e a introdução de microrganismos associados à fauna selvagem nos sistemas pecuários de exploração intensiva (Bengis et al., 2004). Na realidade, a leptospirose bovina origina a diminuição do rendimento económico das explorações pecuárias, devido sobretudo ao impacte nos programas de reprodução. Os prejuízos financeiros causados pela infecção crónica do serovar Hardjo (serogrupo Sejroe) decorrem, na sua maioria, da ocorrência de infertilidade, aborto nos últimos meses de gestação, partos prematuros, morte de vitelos de 15-60 dias, morte de animais adultos, diminuição da produção leiteira e cárnea, e rejeição de touros para inseminação artificial (Ellis, 1994). Os roedores, os principais reservatórios renais de Leptospira, assumem um papel muito importante na transmissão dos agentes de doença, tanto aos humanos como aos animais domésticos (Little, 1986). Estudos prévios sobre a ocorrência desta infecção, na fauna selvagem, foram conduzidos no sul e centro de Portugal Continental, e no Arquipélago dos Açores, por Collares-Pereira e colaboradores (2000a), mas não no norte de Portugal. Contudo, o último inquérito serológico em bovinos (n=1.433), efectuado a nível nacional (Paiva-Cardoso et al., 2000), registou taxas elevadas nas regiões mais a norte, designadamente Trás-os-Montes (66,3%), Beira Litoral (53,3%) e Entre Douro e Minho (39,7%), apesar da importante percentagem observada a sul, nas regiões do Alentejo (75,9%) e Ribatejo e Oeste (36,8%). Posteriormente, seria ainda confirmada a ocorrência de padrões diferentes de aglutinação, nos bovinos analisados, quando comparados com os observados noutras regiões de Portugal (Paiva-Cardoso et al., 2001). Face ao exposto, o principal objectivo da presente investigação foi o de contribuir para o conhecimento da leptospirose bovina no norte de Portugal, em particular em Trás-os-Montes, região onde a raça Maronesa é criada em sistemas tradicionais de maneio. Com efeito, a criação do Maronês tem como principal fonte de rendimento a produção e recria de vitelos para talho, exigindo elevados níveis reprodutivos, o que obriga à implementação de uma estratégia de preservação desta raça autóctone que assenta, além do melhoramento genético, em medidas que tornem a respectiva produção economicamente viável, sem perda da elevada qualidade de carne para consumo. Assim, o presente estudo incluiu, pela primeira vez, a obtenção de isolados de estirpes de Leptospira patogénicas presentes em pequenos mamíferos da região, antecipando um contributo mais específico na investigação inédita do papel desempenhado por estes portadores renais crónicos, nas explorações de bovinos da raça Maronesa, relativamente à leptospirose. Foi capturado um total de 308 animais, em particular roedores, em pequenas explorações de bovinos da região de Trás-os-Montes, com a seguinte distribuição: Mus musculus (n=255), M. spretus (n=24), Rattus norvegicus (n=19), R. rattus (n=3), Apodemus sylvaticus (n=4) e o insectívoro Crocidura russula (n=3) (Paiva-Cardoso et al., 2005a). Após necrópsia e exame bacteriológico dos animais por cultura do rim em meio selectivo, obtiveram-se 17 isolados de leptospiras dos seguintes roedores: 13 Mus musculus, três M. spretus e um Rattus norvegicus. Destes, apenas 14 estirpes foram recuperadas e caracterizadas por aglutinação microscópica, anticorpos monoclonais e enzimas de restrição, sendo posteriormente utilizadas no teste de referência (aglutinação microscópica) durante os inquéritos serológicos aos pequenos mamíferos e bovinos. Foram identificadas 11 estirpes como pertencentes ao serogrupo Ballum (serovar Ballum), uma ao serogrupo Sejroe (serovar Saxkoebing) e as duas restantes ao grupo Pomona (serovar Kunming?), desconhecido até ao momento em Portugal (Paiva-Cardoso et al., 2005a) e com padrões de reactividade muito diferentes dos obtidos com as estirpes dos serovares Mozdok e Tsaratsovo anteriormente isoladas em Portugal (Collares-Pereira et al., 1996, 1997a, 1997b, 2000a, 2000b; Rocha, 1990; Rocha, 2004). Dado que o serovar mais estreitamente relacionado com estas estirpes do serogrupo Pomona foi apenas registado na China (Zhang et al., 1987; Brenner et al., 1999; Salaün et al., 2006), existe a possibilidade destes isolados representarem um novo serovar, cujo significado clínico para a saúde bovina importa avaliar em estudos futuros. No que se refere ao serogrupo Sejroe, o isolamento do serovar Saxkoebing no ratinho-caseiro Mus musculus é um achado com importante valor epidemiológico, não apenas por ser inédito em Portugal, mas também na Península Ibérica (Paiva-Cardoso et al., 2005c). Com o objectivo de complementar os resultados da cultura, para detecção do estado de portador renal nos pequenos mamíferos necropsiados, procedeu-se à amplificação de DNA leptospírico, por tecnologia de PCR (“polymerase chain reaction”), em 278 (90,3%) amostras de tecido renal dos referidos animais. As reacções da PCR foram efectuadas, utilizando três pares de primers, a saber: os primers G1/G2 derivados da sequência genética do plasmídeo recombinante pLIPs60; os primers da sequência genética da LipL21, desenvolvendo o Southern Blotting com uma sonda marcada de 257 pares de bases (pb); e os primers da sequência genética da LipL32, com uma sonda de 423 pb no Southern Blotting. A análise dos resultados da PCR confirmou a presença de DNA leptospírico em 54% (150+/278) dos animais examinados, ou seja, cerca de dez vezes superior à percentagem obtida (5,5%; 17+/308) por cultura. Estes dados bacteriológicos confirmam a ocorrência generalizada de infecção por Leptospira, na população de roedores analisada, e antecipam a acentuada importância destes animais na transmissão de Leptospira spp. ao gado bovino, em particular, no que se refere às infecções acidentais (Paiva-Cardoso et al., 2000b). A pesquisa de anticorpos específicos anti-Leptospira, pelo teste de aglutinação microscópica (TAM), em 282 (91,6%) pequenos mamíferos, revelou uma percentagem de positividade (55%) análoga à registada na abordagem molecular, sinónimo da ocorrência de infecção por leptospiras num passado mais ou menos recente. A utilização de estirpes isoladas localmente, como antigénios “vivos” da TAM, contribuiu para aumentar o valor diagnóstico desta abordagem laboratorial, em animais com uma eventual resposta imune reduzida, dada a sua condição de portador crónico destas espiroquetas. No que se refere ao estudo paralelo da seroreactividade anti-Leptospira nos bovinos, com o objectivo de avaliar indirectamente a presença de infecção acidental por espiroquetas de origem murina, os resultados apontam para uma percentagem elevada (61%) de animais seroreactivos com títulos baixos, iguais ou superiores a 1:10 (título geométrico médio 1:17). Como esperado, os títulos anti-Sejroe foram os mais comuns, com cerca de 26,7% das aglutinações detectadas. Admite-se que este achado seja não só consequência do número acentuado de animais com reactividade anti-Hardjo, enquanto infecção endémica dos bovinos, mas ainda do contacto com o serovar Saxkoebing isolado de Mus musculus presentes no mesmo ecossistema, como já referido. A reactividade de 12,1% com o serogrupo Ballum foi igualmente importante, indicando que a exposição dos bovinos a estirpes deste serogrupo mantidas pelos roedores é frequente nesta região. O serogrupo Pomona evidenciou uma prevalência serológica de 11,8%, compatível com a ocorrência de infecções acidentais com os respectivos serovares, nomeadamente, o serovar Kunming (?) isolado pela primeira vez em Portugal. De salientar que, também no estudo imunológico dos bovinos, a maior imunogenicidade dos antigénios (isolados) utilizados na TAM terá certamente contribuído para esta importante detecção de aglutininas específicas. Os sistemas de maneio intensivo dos bovinos demonstraram ser um risco acrescido para o maior contacto com os roedores infectados, em particular, Mus musculus, principal espécie capturada e com um maior número de isolados obtidos. Contudo, o risco de transmissão de leptospiras por outros roedores é igualmente elevado, face à acentuada seropositividade detectada em Rattus rattus (100%), Apodemus sylvaticus (75%), Mus spretus (56,5%) e Rattus norvegicus (55,7%). Esta evidência corrobora a necessidade de um controlo eficaz dos roedores nas explorações analisadas, dada a inexistência generalizada de medidas de protecção do gado. No distrito de Bragança, onde a presença de aglutininas anti-Leptospira foi muito significativa (p<0,0001), quando comparada com a do distrito de Vila Real, é avançada a hipótese de factores genéticos da raça Mirandesa, como susceptíveis de justificar a diferença, mas mais estudos eco-epidemiológicos são necessários para explicar esta característica diferencial. Em oposição, a raça Maronesa demonstrou ser menos susceptível à leptospirose do que as restantes raças, sendo igualmente sugeridos os factores genéticos, além do tipo de maneio do gado, como razões possíveis para esta situação. Em conclusão, a infecção por Leptospira está muito disseminada nos roedores da região de Trás-os-Montes e a percentagem de portadores crónicos renais é suficientemente elevada para causar preocupação na produção das raças autóctones de bovinos, incluindo a Maronesa, apesar da sua (aparente) maior resistência à doença. Importa, por isso, implementar medidas de vigilância e de controlo desta doença endémica, na região de Trás-os-Montes, de modo a reduzir não só as suas consequências para a saúde humana e animal, como os efeitos sociais e económicos que lhe são inerentes.