Brucella spp. in aquatic mammals of Brazil: serological, molecular, histopathological and immunohistochemical investigation

• Main Author: Sarmiento, Angelica Maria Sanchez
• Other Authors: Dias, José Luiz Catão
• Format: Doctoral or Postdoctoral Thesis
• Language: English
• Published: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP 2018
• Subjects: América do Sul; Brucelose; Pinípedes; Cetáceos; Patologia; Pinnipeds; Pathology; Cetaceans; Brucellosis; South America; Aguda; Elefante; Indian; Nordeste; Elephant Seals; Killer Whale; Mirounga leonina; Orca; South Atlantic Ocean; Southern Elephant Seals; Killer whale
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10133/tde-17082018-152324/; https://doi.org/10.11606/T.10.2018.tde-17082018-152324

Aquatic mammals are sentinels of zoonotic pathogens that may be a threat to species conservation, to humans and domestic animals. Brucella genus is responsible for brucellosis, one of the main widespread zoonosis. In aquatic mammals, Brucella spp. was firstly described in 1994 and currently there are two recognized species infecting that group: B. ceti and B. pinnipedialis. In cetaceans, Brucella spp. has been linked to asymptomatic infection, acute or chronic disease and several pathological processes which may lead to stranding and/or death. In pinnipeds, pathogenicity of Brucella spp. is still unclear. Data about Brucella spp. in aquatic mammals in South Atlantic Ocean particularly in Brazil is limited, with a significant knowledge gap despite the rich diversity of this group. In this research, we investigated exposure to and/or infection by Brucella spp. by serological, molecular, histopathological, immunohistochemical and microbiological methods in samples of aquatic mammals of Brazil kept at the Marine Mammal Tissue Bank, Department of Pathology, School of Veterinary Medicine and Animal Sciences, University of São Paulo, Brazil. Sera from 63 cetaceans [families Iniidae (n=37), Delphinidae and Kogiidae (n=26)], 35 pinnipeds (Southern elephant Seals, Mirounga leonina), and 21 West Indian manatees (Trichechus manatus) were tested via the Rose Bengal Test, a commercial competitive enzyme-linked immunosorbent assay (c-ELISA) and the serum agglutination test (SAT; selected c-ELISA positives) to detect Brucella spp. antibodies. In addition, DNA from selected samples of 124 cetaceans, 4 pinnipeds and 1 manatee were analyzed by conventional PCR and/or real-time PCR (qPCR) targeting the genus Brucella spp. Culture, histopathology and immunohistochemistry (IHC) were performed in samples from exposed or infected individuals (serology and/or conventional PCR/qPCR positives; n=13). Antibodies against Brucella spp. were detected in 3/35 (8.6%) of the M. leonina tested while Iniidae and Kogiidae cetaceans and manatees were negative. Brucella spp. DNA was detected in 4/124 (3.2%) of the cetaceans tested by conventional PCR/qPCR: one Clymene dolphin (Stenella clymene) with acute brucellosis, positive by serology and IHC; and three other individuals without available sera: one asymptomatic Franciscana (Pontoporia blainvillei), positive by qPCR and IHC; one case of chronic brucellosis in a Spinner dolphin (Stenella longirostris) presenting fibrinosuppurative atlanto-occipital osteoarthritis with abscess formation, positive by qPCR and by IHC; one Guiana dolphin (Sotalia guianensis), positive by conventional PCR/qPCR and by IHC and previously diagnosed with cetacean morbillivirus. Despite negative PCR amplification, Brucella-type lesions were found in one S. clymene and one pigmy killer whale (Feresa attenuata), both positive by serology and by IHC. Positive serology and/or IHC suggested exposure and/or Brucella-infection in three short-finned pilot whale (Globicephala macrorhynchus), two melon-headed whale (Peponocephala electra), a bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) and a S. clymene. Main part of the Brucella spp. exposed or infected cetaceans came from State of Ceará, Northeastern Brazil. Culture was not successful, hampering strains classification. All the pinnipeds and the manatees tested by PCR were negative. Opportunistic screening of Leptospira spp. exposure via the microscopic agglutination test on all sera samples used for the Brucella spp. screening gave negative results. In conclusion, we found Brucella spp. exposure, asymptomatic infection, as well as cases of acute and chronic brucellosis and coinfection by Brucella spp. and other pathogens. To our knowledge, this research is the first long-term survey of Brucella spp. in aquatic mammals in South America, widening the hosts and the geographic range of this agent and contributing to the understanding of pathological and epidemiological aspects of its infection. Further research is needed to fully characterize the strains involved, evaluate their public health relevance and the possible occurrence and impacts in other species of aquatic mammals in Brazil. Os mamíferos aquáticos são sentinelas de patógenos zoonoticos, os quais podem representar uma ameaça a sua conservação, aos humanos e aos animais domésticos. O género Brucella é responsável pela brucelose, uma das zoonoses mais comuns. Nos mamíferos aquáticos Brucella spp. foi descrita pela primeira vez em 1994 e atualmente duas espécies são reconhecidas nesse grupo: B. ceti e B. pinnipedialis. Nos cetáceos, Brucella spp. tem sido associada a infecção assintomática, doença aguda ou crônica e diversos processos patológicos que podem levar ao encalhe e/ou morte. Nos pinípedes, a patogenicidade de Brucella spp. ainda não é clara. Dados sobre Brucella spp. em mamíferos aquáticos no Oceano Atlântico Sul, particularmente no Brasil, são limitados com uma significativa lacuna de conhecimento mesmo com a rica diversidade. Nesta pesquisa, investigou-se exposição a e/ou infecção por Brucella spp. com métodos sorológicos, moleculares, histopatológicos, imunohistoquimicos e microbiológicos em amostras de mamíferos aquáticos do Brasil armazenadas no banco de tecidos de mamíferos marinhos, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo. Soro de 63 cetáceos [famílias Iniidae (n=37), Delphinidae e Kogiidae (n=26)], 35 pinipedes (Elefante-marinho-do-sul, Mirounga leonina) e 21 peixe-bois marinhos (Trichechus manatus) foi testado pelo Rosa de Bengala, um kit comercial de ensaio imunossorvente ligado a enzima de competição (c-ELISA) e a prova de soroaglutinação lenta em tubo (SAT; c-ELISA positivos selecionados) para detecção de anticorpos anti-Brucella spp. Em adição, DNA de amostras selecionadas de 124 cetáceos, 4 pinípedes e 1 peixe-boi marinho foram analisadas pelo PCR convencional e/ou em tempo real (qPCR) tendo como alvo o gênero Brucella spp. Realizou-se cultivo, histopatologia e imunohistoquimica (IHQ) nas amostras dos indivíduos expostos ou infectados (positivos na sorologia e/ou PCR convencional/qPCR; n=13). Anticorpos anti-Brucella spp. foram detectados em 3/35 (8.6%) dos M. leonina testados enquanto cetáceos das famílias Iniidae e Kogiidae e os peixe-bois foram negativos. DNA de Brucella spp. foi detectado em 4/124 (3.2%) dos cetáceos analisados por PCR convencional/qPCR: um golfinho-climene (Stenella clymene) com brucelose aguda, positivo pela sorologia e IHQ; e três indivíduos adicionais sem soro disponível: uma Franciscana (Pontoporia blainvillei), assintomática, positiva pela qPCR e IHQ; um caso de brucelose crônica em um golfinho-rotador (Stenella longirostris), apresentando osteoartrite fibrinosupurativa atlantoccipital com formação de abcesso, positivo pela qPCR e IHQ; um boto-cinza (Sotalia guianensis), positivo pela PCR convencional/qPCR e IHQ e previamente diagnosticado com morbillivirus dos cetáceos. Apesar da PCR negativa, lesões compatíveis com brucelose foram encontradas em um S. clymene e uma orca-pigmeia (Feresa attenuata), ambos positivos pela sorologia e IHQ. Exposição e/ou infecção por Brucella spp. foi confirmada pela sorologia e/ou IHQ positiva em três baleia-piloto-de-aleta-curta (Globicephala macrorhynchus), dois golfinhos cabeça de melão (Peponocephala electra), um golfinho nariz de garrafa (Tursiops truncatus) e um S. clymene. A maior parte dos cetáceos expostos a/ou infectados por Brucella spp. foram provenientes do estado de Ceará, nordeste do Brasil. A cultura não foi bem-sucedida, prejudicando a classificação das cepas envolvidas. Todos os pinípedes e peixe-bois testados foram negativos na PCR. Triagem oportunistico para avaliar exposição a Leptospira spp. por meio do teste de aglutinação microscópica nos soros testados para Brucella spp. foi negativo. Em conclusão, confirmou-se exposição a Brucella spp., infecção assintomática, brucelose aguda e crônica e coinfecção por Brucella spp. e outros agentes patogênicos. Dentro de nosso conhecimento, esta pesquisa constitui o primeiro trabalho de longo prazo sobre Brucella spp. em mamíferos aquáticos na América do Sul, ampliando a sua faixa de hospedeiros e localização geográfica e contribuindo na compreensão dos aspectos patológicos e epidemiológicos de sua infecção. Pesquisas adicionais são necessárias para caracterizar as cepas envolvidas, avaliar a sua relevância na saúde publica, bem como sua possível ocorrência e impactos em outras espécies de mamíferos aquáticos no Brasil.