Caratterizzazione molecolare e funzionale della Polinucleotide fosforilasi dall'eubatterio antartico Pseudoalteromonas Haloplanktis - EVANGELISTA, Giovanna (Università degli studi del Molise, 2010)
L’enzima polinucleotide fosforilasi (PNPasi, E.C. 2.7.7.8) è coinvolto nel metabolismo dei nucleotidi, sia negli eucarioti che nei procarioti. L’enzima catalizza la degradazione fosforolitica dell’RNA, rilasciando nucleosidi 5’-difosfato dall’estremità 3’ del substrato, e la reazione inversa di polimerizzazione. In questo lavoro è descritta la purificazione e la caratterizzazione biochimica della PNPasi isolata dall’eubatterio psicrofilo di origine Antartica Pseudoalteromonas haloplanktis (Ph, temperatura ottimale di crescita 4-20°C) identificata sulla base della sua capacità di catalizzare la seguente reazione reversibile: RNA(n) + Pi ↔ RNA(n-1) + ppN L’enzima ha mostrato una struttura omotrimerica con un Mr pari a 255000, come valutato da analisi della massa molecolare in condizioni native e denaturanti. Utilizzando software bioinformatici dedicati sono state ottenute, a partire dalla sequenza amminoacidica, predizioni della struttura secondaria e terziaria del monomero. Inoltre, sono stati condotti studi sulla composizione amminoacidica che hanno permesso di evidenziare che la PhPNPasi mostra i tipici adattamenti delle proteine psicrofile. I parametri cinetici sono stati determinati a 15°C, utilizzando poli(A) come primer e GDP marcato come substrato. E’ stato valutato l’effetto sull’attività enzimatica di concentrazioni crescenti di GDP, consentendo di calcolare i parametri cinetici. L’attività della PhPNPasi è risultata essere stimolata dalla presenza di alcuni cationi monovalenti nella miscela di reazione, caratteristica già evidenziata per un altri enzimi isolati da P. haloplanktis. Tra essi il CsCl ad una concentrazione 0,9 M è risultato il più efficace, aumentando l’attività dell’enzima di circa 7 volte. L’attività enzimatica della PhPNPasi aumenta con l’incremento della temperatura, raggiungendo un valore massimo a 40°C; oltre questa temperatura si osserva un decremento della velocità di reazione, probabilmente dovuto alla sua inattivazione termica. Nell’intervallo 0-40°C è stato calcolato un valore di ...