Clostridium botulinum ryhmän II CRISPR-mutanttikantojen karakterisointi populaatiotasolla

• Main Author: Mansour, Mira
• Other Authors: Helsingin yliopisto, Eläinlääketieteellinen tiedekunta, University of Helsinki, Faculty of Veterinary Medicine, Helsingfors universitet, Veterinärmedicinska fakulteten
• Format: Master Thesis
• Language: Finnish
• Published: Helsingin yliopisto 2020
• Subjects: Clostridium botulinum; botulismi; spo0A; sigK; orfX2; amyE; toksiinintuotannon ja itiöinnin geneettinen säätely; Eläinlääketieteen lisensiaatin koulutusohjelma; Degree programme in veterinary medicine; Utbildningsprogrammet i veterinärmedicin; Jota; Beluga; Beluga*
• Online Access: http://hdl.handle.net/10138/326611

Clostridium botulinum on gram-positiivinen itiöitä muodostava sauvamainen anaerobibakteeri, jota esiintyy yleisesti ympäristössä. C. botulinum tuottaa myrkyllisintä tunnettua yhdistettä, botuliinineurotoksiinia. Botuliinineurotoksiini aiheuttaa ihmisille ja eläimille botulismina tunnettua halvaussairautta, joka voi johtaa hoitamattomana jopa kuolemaan. Etenkin C. botulinum ryhmä II on elintarvikehygienian kannalta merkittävä, sillä ryhmän bakteerit kasvavat jääkaappilämpötiloissa, mikä aiheuttaa riskin jääkaapissa säilytettävien elintarvikkeiden turvallisuudelle. C. botulinum -bakteerin itiöinnin ja toksiinintuotannon geneettisiä säätelymekanismeja ei vielä tunneta täysin. Jotta voisimme saada lisää tietoa keinoista parantaa elintarvikkeiden turvallisuutta, on tärkeää saada lisää tietoa etenkin bakteerin toksiinintuotannosta. Koska on viitteitä siitä, että toksiinintuotannon ja itiöinnin välillä olisi yhteistä geneettistä säätelyä, on myös tärkeää saada lisää tietoa bakteerin itiöinnistä. Lisensiaatintutkielman tutkimusosassa tutkittiin uudella CRISPR-Cas9-menetelmällä valmistettuja kantoja. C. botulinum ryhmän II Beluga-kannasta oli yksitellen deletoitu geenit spo0A, sigK, orfX2 ja amyE. Tutkimuksessa selvitettiin, miten deleetio vaikuttaa bakteerien kasvuun, itiöintiin, toksiinintuotantoon ja solumorfologiaan. Bakteerikasvua seurattiin mittaamalla spektrofotometrilla optista tiheyttä sekä MPN (most probable number) -menetelmällä bakteerimääriä. Itiöintiä mitattiin kuumentamalla näytteitä vegetatiivibakteerien tuhoamiseksi ja edelleen MPN-menetelmällä. Toksiinintuotantoa mitattiin immunologisella ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) -testillä. Solujen morfologiaa tutkittiin gram- ja itiövärjäyksillä. spo0A ja sigK ovat keskeisiä itiöintiin vaikuttavia geenejä. Tutkimuksessa spo0A-geenimutantti (∆spo0A) ei itiöitynyt ollenkaan, ja spo0A-geenin deleetio vaikutti negatiivisesti bakteerien kasvuun. ∆sigK ei kyennyt itiöitymään, mutta itiövärjäyksessä havaittiin malakiittivihreällä värjäytyviä esi-itiöitä ...