One-source-Standards zur Bestimmung von positionsspezifischen Proteinphosphorylierungsgraden erlauben genauere Einblicke in die intrazelluläre Signaltransduktion

• Main Author: Hahn, Bettina
• Format: Doctoral or Postdoctoral Thesis
• Language: German
• Published: 2011
• Subjects: 570; 570 Life sciences; Antarktis*
• Online Access: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/11771/; https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/11771/1/Doktorarbeit.pdf; https://doi.org/10.11588/heidok.00011771; https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:16-opus-117713

Reversible Proteinphosphorylierung ist ein Schlüsselprinzip der intrazellulären Signaltransduktion. Häufig wird eine Änderung des Phosphorylierungsstatus als relative Änderung zu einem Anfangsstatus angegeben. Hingegen bietet der Phosphorylierungsgrad eine wesentlich informativere Systembeschreibung und eine fundierte Grundlage für Modellrechnungen. One-source-Peptid-/Phosphopeptidstandards wurden mit dem Ziel entwickelt, Phosphorylierungsgrade von Proteinen positionsspezifisch und mit hoher Genauigkeit zu bestimmen. Kernpunkt der Methode ist die Erzeugung einer Mischung eines stabilisotopenmarkierten Peptid-/Phosphopeptid-Standardpaars, dessen stöchiometrisches Verhältnis exakt bekannt ist. Dazu wird eine Lösung des Phosphopeptidstandards in zwei Aliquots geteilt. Ein Aliquot wird mit antarktischer Phosphatase dephosphoryliert, während das andere Aliquot unbehandelt bleibt. Die Phosphatase wird anschließend durch kurzzeitiges Erhitzen irreversibel inaktiviert und aus beiden Lösungen eine volumetrisch definierte Mischung hergestellt. Die Standardpaare wurden den immunpräzipitierten und mittels SDS-Gelelektrophorese gereinigten Zielproteinen auf der Stufe des Verdaus zugegeben und die Analysen mittels nano-Ultra-Hochleistungsflüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie durchgeführt. Bei Peptiden mit zwei Phosphorylierungsstellen erlaubte die Einführung mehrerer Isotopenmarkierungen eine individuelle Quantifizierung aller vier möglichen Formen. Zunächst wurde die Methode anhand der Parameter Wiederfindung, Richtigkeit und Reproduzierbarkeit erfolgreich validiert. Der relative Fehler bei der Analyse technischer Replikate betrug durchschnittlich weniger als 10 %, bei biologischen Replikaten hingegen 29 %. Der lineare Messbereich umfasste etwa zwei Größenordnungen, und die untere Bestimmungsgrenze für Phosphopeptide lag bei 10-20 fmol. Die Methode wurde auf die Phosphorylierungsgradbestimmung der Signalproteine STAT6, Akt1, ERK1 und ERK2 in verschiedenen Zellsystemen angewandt. Im Vordergrund stand die Analyse ...