Mechanistic investigations of benzylic sulfate ester hydrolysis using inverting and retaining sulfatases - Tösch, Michael (2014)
Die Alkylsulfatase Pisa1 aus dem Pseudomonas Stamm DSM 6611 ist in der Lage ein breites Spektrum an Alkylsulfatestern umzusetzen. Enantioselektivitäten, gemessen in E-Werten, reichten von sehr gering (4) bis hervorragend (>200). Im Zuge der Erweiterung des Substratspektrums war es möglich eine Reihe an Benzylsulfaten zu derazemisieren, inklusive eines Pyridin-Heterozyklus, welcher perfekte E-Werte zeigte. Während der kinetischen Razemtrennung wurde ein Abnehmen des Enantiomerenüberschusses in der Kontrollreaktion beobachtet. Zur Aufklärung des zugrunde liegenden Mechanismus wurde H218O verwendet und der resultierende Einbau des 18O im Produkt verfolgt, wodurch gezeigt wurde dass es sich um eine Kombination aus SN1 und SN2 Mechanismus im Verhältnis 1:1.6 handelt. Der SN1-Reaktion liegt ein planares resonanz-stabilisiertes Carbokation Intermediat zugrunde, welches zur Razemisierung des Produkts führt. Der SN2 Mechanismus führt zur Inversion über einen nukleophilen Angriff am C-Atom. Retention ([OH-]-Angriff am Schwefel) wurde nur zu <3 % beobachtet. Während der Katalyse ist Pisa1 in der Lage, eine chemisch überaus anspruchsvolle Reaktion, die Inversion mit gleichzeitiger Protonierung der schlechten Abgangsgruppe SO42- zu HSO4-, zu ermöglichen. Mit diesem Wissen wurden zinkabhängige Hydrolasen, unter der Berücksichtigung der räumlichen Anordnung wichtiger Aminosäurereste, untersucht und eine "Catalophor-Suche", durchgeführt. Diese förderte drei viel versprechende Kandidaten zutage: Die Alkaline Phosphatase aus Pandalus borealis (AP), eine putative metallabhängige Hydrolase aus Lactobacillus casei, sowie die Ser/Thr Phosphatase 5 aus dem Menschen. Nach eingehendem Substratscreening zeigten weder AP noch die putative Hydrolyse Aktivität. Das Humanenzym bleibt ein viel versprechendes Ziel zur Hydrolyse von Alkylsulfaten. The alkyl sulfatase Pisa1 from Pseudomonas sp. DSM 6611 has been shown to accept a large amount of alkyl sulfate esters. Enantioselectivities, measured as E-values, were ranging from very low ...