Κατευθυνόμενη εξέλιξη δύο ενζυμικών μορίων

• Main Authors: Κουτσιούλης, Δημήτρης, Koutsioulis, Jim
• Other Authors: Μπουριώτης, Βασίλης
• Format: Text
• Language: Greek
• Published: 2001
• Subjects: Antarctic; The Antarctic; Antarc*
• Online Access: http://elocus.lib.uoc.gr:443/dlib/4/a/2/metadata-dlib-2001koutsioulis.tkl

In the present study we employed directed evolution in order to improve selected properties of two enzymes: chitin deacetylase Cda2p from the zymomyces Saccharomyces cerevisiae and alkaline phosphatase from the Antarctic strain TAB5. The properties-targets for Cda2p were product inhibition by acetic acid and the incapability of the enzyme to act upon insoluble chitin substrates, while for TAB5AP the low thermostability. We applied error prone PCR on both genes and subsequently screened the mutated libraries. Unfortunately, the existing screening assays for Cda2p, didn't match with the needs of our experiments, so we were unable to screen the mutated clones. On the other hand we screened approximately 5500 clones from the TAB5AP libraries and selected 12 clones, which demonstrated higher levels of thermostability as compared to the wild type enzyme. Finally, we cloned and overexpressed the CDA2 gene in Escherichia coli. At the same time we designed two schemes of partial purification of the recombinant protein. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της κατευθυνόμενης εξέλιξης για την τροποποίηση ενζυμικών ιδιοτήτων. Δυο ένζυμα αποτέλεσαν τo αντικείμενo της ερευνητικής προσπάθειας: η απακετυλάση της χιτίνης Cda2p από το ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae και η αλκαλική φωσφατάση από το ανταρκτικό στέλεχος ΤΑΒ5. Οι ιδιότητες στόχοι για την Cda2p ήταν η αναστολή του ενζύμου από το οξικό οξύ και η αδυναμία δράσης σε αδιάλυτα υποστρώματα χιτίνης, ενώ για την ΤΑΒ5ΑΡ ήταν η χαμηλή θερμοσταθερότητα. Μετά από τη χρήση της τεχνικής error prone PCR στα παραπάνω γονίδια, ακολούθησε η σάρωση των βιβλιοθηκών από μεταλλαγμένους κλώνους. Στην περίπτωση της Cda2p και λόγω της ακαταλληλότητας των διαθέσιμων τεχνικών σάρωσης, δεν έγινε δυνατός ο έλεγχος των μεταλλαγμένων κλώνων. Στην περίπτωση όμως της ΤΑΒ5ΑΡ ελέγχθηκαν περίπου 5500 κλώνοι από τους οποίους 12 εμφανίστηκαν με υψηλότερη θερμοσταθερότητα από το ένζυμο αγρίου τύπου. Τέλος στην προσπάθεια έκφρασης του ενζύμου Cda2p σε ικανοποιητικά επίπεδα κλωνοποιήθηκε το ...