Uporaba metode CRISPR-Cas9 za zamenjavo posamičnega nukleotida in njen vpliv na genom kvasovke Saccharomyces cerevisiae
CRISPR-Cas9 je metoda za urejanje genoma, ki nam omogoča spreminjanje poljubnega zaporedja v genomu različnih organizmov. Deluje na osnovi sistematičnega uvajanja dvojnih prelomov DNA v izbrano zaporedje in uporabi celici lastnih popravljalnih mehanizmov za njihovo popravljanje na osnovi zaporedja D...
| Main Author: | |
|---|---|
| Other Authors: | |
| Format: | Master Thesis |
| Language: | Slovenian |
| Published: |
2022
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?id=140892 https://repozitorij.uni-lj.si/Dokument.php?id=161721&dn= https://plus.cobiss.net/cobiss/si/sl/bib/131912963 https://hdl.handle.net/20.500.12556/RUL-140892 |
| Summary: | CRISPR-Cas9 je metoda za urejanje genoma, ki nam omogoča spreminjanje poljubnega zaporedja v genomu različnih organizmov. Deluje na osnovi sistematičnega uvajanja dvojnih prelomov DNA v izbrano zaporedje in uporabi celici lastnih popravljalnih mehanizmov za njihovo popravljanje na osnovi zaporedja DNA, ki ga v celico vnesemo sami. V kvasovki Saccharomyces cerevisiae se dvojni prelomi DNA lahko popravijo na dva načina. Prvi je homologna rekombinacija (HR), ki velja za prevladujočega, drugi pa je povezovanje nehomolognih koncev (NHEJ). Posledica NHEJ so pogosto indeli, torej krajše insercije in delecije, ter zamenjave nukleotidov na mestu dvojnega preloma, ki nastanejo zaradi procesiranja koncev. Da bi razvili metodo, s katero bomo lahko v genomu kvasovke na enostaven način zamenjali posamičen nukleotid s čim manj netarčnimi učinki delovanja encima Cas9, smo poskušali čim bolje okarakterizirati neželene učinke, ki nastanejo pri zamenjavi posamičnega nukleotida s CRISPR-Cas9. Opazovali smo vpliv delecije gena NEJ1, ki spodbuja NHEJ, vrste matrične DNA, ki jo uporabimo kot osnovo za popravljanje dvojnih prelomov po delovanju Cas9 in vpliv izgube komponent sistema CRISPR-Cas9 na učinkovitost delovanja sistema in nastanek indelov. Indele in druge netarčne učinke smo okarakterizirali tako na ravni posameznega tarčnega lokusa (v genu IXR1) kot na ravni celotnega genoma. Za to smo uporabili metode določanja nukleotidnega zaporedja naslednje generacije: sekvenciranje amplikonov in sekvenciranje celotnega genoma. Na osnovi sekvenciranja amplikonov in analize tako pridobljenih rezultatov smo opisali vpliv CRISPR-Cas9 na zaporedje tarčnega mesta na genomu oziroma v okolici dvojnega preloma DNA, če celica ne vsebuje matrice za HR. S sekvenciranjem celotnega genoma smo opisali še indele in zamenjave nukleotidov, ki so se pojavljali drugod v genomu in pri sekvenciranju amplikonov v analizo niso bili zajeti. Ugotovili smo, da se po delovanju sistema CRISPR-Cas9 v okolici tarčnega mesta na genomu, če ga ne spremenimo s HR z ... |
|---|