Detecção de potenciais patógenos de ostras de cultivo em Santa Catarina e investigação de mecanismos de defesa imune e antioxidante

• Main Author: Mello, Danielle Ferraz
• Other Authors: Dafre, Alcir Luiz, Universidade Federal de Santa Catarina
• Format: Doctoral or Postdoctoral Thesis
• Language: Portuguese
• Published: 2016
• Subjects: Bioquímica; Ostra; Doenças; Bivalve (Molusco); Pacific; Crassostrea gigas
• Online Access: https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/168184

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016 Ostras são organismos de ampla relevância econômica e ecológica. Contudo, mortalidades massivas de ostras têm aumentado em frequência e distribuição geográfica ao redor do mundo. Desta forma, estudos básicos a respeito da biologia desses animais, incluindo seus sistemas de defesa, são de fundamental importância. O presente trabalho investigou a presença de patógenos de bivalves em ostras cultivadas em Santa Catarina, os quais têm sido associados a mortalidades de ostras em outros países (Estudo 1). Além disso, buscou-se compreender melhor a respeito da relação entre os sistemas antioxidante e imune de ostras (Estudos 2 e 3). No Estudo 1, ostras do Pacífico Crassostrea gigas e nativas C. gasar (= C. brasiliana)foram coletadas ao longo da costa de Santa Catarina e avaliadas quanto à presença do vírus Ostreid herpesvirus 1 (OsHV-1) e das bactérias Vibrio aestuarianus e V. splendidus. Análises moleculares revelaram amostras positivas para V. splendidus (15 %) e OsHV-1 (28 %), sendo confirmadas por análises de sequenciamento. Este foi o primeiro trabalho demonstrando a presença de bactérias e vírus potencialmente patogênicos em ostras na costa brasileira, servindo de alerta para que medidas preventivas sejam adotadas para evitar o surgimento de mortalidades massivas de ostras no país. No Estudo 2, hemócitos de ostras C. gigas foram expostos ao agente eletrofílico 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB). O CDNB não afetou a viabilidade mitocondrial, entretanto, diminuiu a estabilidade da membrana lisossomal dos hemócitos (= 12,5 µM). O CDNB causou um forte distúrbio no sistema antioxidante, promovendo depleção da glutationa (= 0,1 µM) e inibição das enzimas glutationa redutase (2,5 e 50 µM) e tioredoxina redutase (50 µM). Importantes funções desempenhadas pelos hemócitos (adesão, fagocitose e produção de espécies reativas de oxigênio após imunoestimulação) foram comprometidas somente por 50 µM de CDNB. Os resultados indicam que a depleção total de glutationa não afeta a imunocompetência dos hemócitos, porém ocorre mediante uma inibição adicional de tiol redutases. No Estudo 3, a importância da glutationa para o sistema imune das ostras foi avaliada utilizando-se butionina sulfoximina (BSO), inibidor da síntese de glutationa. Ostras C. gigas foram expostas via intramuscular ao BSO (15 µmol/animal) por 1, 2 3 ou 6 dias, sendo observados menores níveis de glutationa (21-46 %) nas brânquias, glândula digestiva e hemócitos. O tratamento de 3 dias não afetou o hemograma das ostras, nem a viabilidade e capacidade de adesão e fagocitose dos hemócitos. Contudo, aumentou significativamente a susceptibilidade das ostras ao patógeno V. anguillarum (33 %), e de forma marginalmente significativa às espécies V. alginolyticus e V. harveyi. A depleção parcial da glutationa também aumentou a susceptibilidade das ostras ao peróxido de hidrogênio e hidroperóxidode cumeno. Os Estudos 2 e 3 sugerem que a glutationa não é indispensável para a função dos hemócitos, porém, quando outros componentes do sistema antioxidante são afetados, ou quando um segundo fator de estresse é aplicado, a homeostase destas células ou do organismo é comprometida. De forma geral, estes estudos básicos abrem caminho para vários outros nas áreas de aquicultura e ecotoxicologia, e contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvendo respostas imunes e antioxidantes de bivalves. Abstract: Oysters are organisms that play important role economically andfor the natural ecosystems. However, oyster massive mortalities have increased in intensity and geographic distribution worldwide. Therefore, studies aiming basic knowledge regarding the biology of oysters are pivotal, especially regarding their defense mechanisms.Thus, the aim of this study was to investigate the presence of oyster pathogens in Santa Catarina, Brazil, which have been associated to oyster massive mortalities in other countries (study 1). Moreover, another aim was tocontribute to basic knowledge regarding the interrelationship of the immune and antioxidant system in oysters (studies 2 and 3). For the 1st study, Pacific oysters Crassostrea gigas and native oysters C. gasar (=C. brasiliana) were collected throughout the coast of Santa Catarina, and the presence of the virus Ostreid herpesvirus (OsHV-1), and the bacteria Vibrio aestuarianus and V. splendidus were evaluated. PCR analyses revealed positive samples for V. splendidus (15 %) and OsHV-1 (28 %), which was confirmed by sequencing analyses. This was the first study to investigate viral and bacterial pathogens to oysters in Brazil, and enlightens the need of preventive measures to be undertaken in order to avoid oyster massive mortalities in Santa Catarina. For the 2nd study, C. gigas hemocytes were in vitro exposed to the electrophilic agent 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB). CDNB did not affect hemocyte mitochondrial viability, however decreased lysosomal membrane stability (=12.5 µM).CDNB strongly affected hemocyte antioxidant system by depleting glutathione (=0.1 µM) and by decreasing the activity of the enzymes glutathione reductase (2.5 and 50 µM) and thioredoxin reductase (50 µM). Hemocyte function (adhesion, phagocytosis, and reactive oxygen species production upon immunostimulation) were jeopardized only with CDNB 50 µM. These results revealed that total glutathione depletion does not affect hemocyte immunocompetence, however this may occur upon inhibition of thiol reductases. For the 3rd study, the importance of glutathione to the immune system of oysters was investigated by using butionine sulfoximine (BSO), an inhibitor of the glutathione synthesis.Oysters C. gigas were exposed to BSO through intramuscular injections (15 µmol/animal/day) for 1, 2, 3 or 6 days, which promoted reduced glutathione levels (21-46 %) in the gills, digestive gland and hemocytes. The injection protocol of 3 days did not affect oyster hemogram, hemocyte viability, adhesion and phagocytosis. Nevertheless, it significantly increased oyster susceptibility to the pathogenV. anguillarum (33 %), while only a trend was observed for thespeciesV. alginolyticusandV. harveyi. Glutathione partial depletions also increased oyster susceptibility to cumene and hydrogen peroxides. Studies 2 and 3 suggest that glutathione is not imperative for hemocyte function, however when other components associated to the antioxidant system are affected, or when a second stress challenge is applied, these cells or the whole organism homeostasis is impaired.Overall, these basic studies can make way for many others in the field of aquaculture and ecotoxicology, and contribute to a better understanding of the mechanisms guiding the immune and antioxidant responses of bivalves.