Multidisciplinary approach for recombinant protein production bioprocess design with classic and novel expression systems in Pichia pastoris

• Main Author: Garrigós Martínez, Javier
• Other Authors: [e-mail], true, Valero Barranco, Francisco, Montesinos Seguí, José Luis, Garcia Ortega, Xavier
• Format: Doctoral or Postdoctoral Thesis
• Language: English
• Published: Universitat Autònoma de Barcelona 2021
• Subjects: Pichia pastoris; Proteïna recombinant; Proteína recombinante; Recombinant protein; Enginyeria de bioprocés; Ingeniería de bioprocesos; Bioprocess engineering; Tecnologies; 62; Rugosa; Antarc*; Antarctica
• Online Access: http://hdl.handle.net/10803/671119

La present tesi doctoral es centra en la caracterització de sistemes d’expressió utilitzats per a la producció de proteïnes recombinants (RPP) en el llevat metilotròfic Pichia pastoris. Al llarg de tot aquest treball s’integren els resultats de diferents camps -enginyeria de bioprocessos i regulació génica- per tal d’ampliar la informació sobre els sistemes d’expressió analitzats i, així, reduir la incertesa a l’dissenyar un bioprocés RPP. En el primer capítol de la tesi, s’estudia el sistema clàssic d’expressió basat en el PAOX1. En un primer pas, es van cultivar en quimiòstat dos clons productors de la Lipasa 1 de Candida rugosa (Cr1l) amb diferent dosi gènica. D’aquesta manera, es va determinar la interrelació de tres factors importants en els bioprocessos RPP com ara la velocitat específica de creixement (μ), els nivells d’expressió relativa de el gen heteròleg (RTL) i la velocitat específica de generació de producte (qp) . A més, també es va monitoritzar l’expressió d’un factor de transcripció important per a la via d’utilització de metanol (MIT1). Un cop establertes les condicions òptimes d’operació en continu, es van dur a terme cultius en fed-batch per validar i comparar el comportament dels clons productors observat, tant des del punt de vista del seu estat fisiològic com de la cinètica de producció de Crl1 . Els inconvenients de l’ús de el potent sistema d’expressió basat en PAOX1-principalment derivat de l’ús de l’metanol com a font de carboni, font d’electrons i inductor de RPP- han portat a la comunitat de Pichia a investigar i desenvolupar sistemes d’expressió alternatius que no depenguin de l’addició de metanol. A causa d’això, en el segon capítol de la tesi, es van caracteritzar dos nous sistemes d’expressió, basats en el PPDF i PUPP, per determinar si poden competir amb l’àmpliament utilitzat PGAP en la producció de la Lipasa B de Candida antarctica (Calb) . El comportament dels tres sistemes d’expressió es va comparar, en primer lloc, en quimiòstat. Això va permetre obtenir informació sobre la ...