Assessment of sigK Deletion on Clostridium botulinum Group II Type E Sporulation and Toxin Production - Laurila, Krista (2020)
Opinnäytetyön tavoitteena oli tutkia sigmatekijä K:n poiston vaikutuksia Belugan, Clostridium botulinum ryhmä II tyyppi E -kannan itiönmuodostukseen sekä toksiinin tuottoon. C. botulinum -bakteerin useat kannat eroavat toisistaan, eikä eri kantojen geneettisiä toimintatapoja tunneta vielä kovin tarkasti. Tämän anaerobisen bakteerin erittämä hermomyrkky botuliini on myrkyllisin tunnettu toksiini, ja sen tuottamat itiöt voivat selviytyä ja kasvaa ruuassa jopa kuumennuksen jälkeen. Hermomyrkyn aiheuttama botulismi on hengenvaarallinen ja parantumaton tauti, joten lajin tuntemus on tärkeää sairastapausten ehkäisemiseksi. Projekti suoritettiin Helsingin yliopiston Eläinlääketieteellisen tiedekunnan Elintarvikehygienian ja ympäristöterveyden osastolle, C. botulinum -laboratorion tiloissa. Projektissa tutkittiin laboratoriossa eri menetelmillä kolmen kymmenen päivän jakson aikana C. botulinum ryhmä II tyyppi E Beluga -kantaa, josta oli poistettu sigK-geeni. Kantaa verrattiin villityyppiin sekä kantaan, josta sigK oli poistettu kromosomista ja lisätty bakteeriin plasmidissa. Mittauksia tehtiin 24 tunnin välein 120 tuntiin asti ja viimeiset mittaukset tehtiin, kun viljelystä oli kulunut 240 tuntia. Työskentely suoritettiin suurelta osin 30 °C:ssa anaerobikaapissa. Ensimmäisten viikkojen aikana laboratoriotutkimus toteutettiin kolmella eri menetelmällä. Näytteitä kuvattiin fluoresenssimikroskoopilla, OD-mittauksilla arvioitiin niiden optista tiheyttä ja MPN-menetelmällä selvitettiin elinkelpoisten solujen sekä kuumennuskäsittelyä sietävien itiöiden määrää. Sen jälkeen ELISA-testeillä määritettiin näytteiden toksiinikonsentraatioita ja mikroskoopilla otettuja kuvia tulkitsemalla laskettiin itiönmuodostuksen eri vaiheissa olevien bakteerien määriä. Tulosten perusteella näyttäisi siltä, että sigK:n puutos Beluga-kannassa vaikuttaa negatiivisesti itiönmuodostuksen viimeisiin vaiheisiin. Bakteerit eivät vapauttaneet suurinta osaa itiöitä, vaan ne jäivät niiden sisään. Itiöiden kypsymisvaiheen kehitys vaikutti myös jääneen kesken. Bakteeripopulaatio pieneni ajan myötä huomattavasti, todennäköisesti elinkelpoisten itiöiden puutteen vuoksi. Toksiinia havaittiin villityyppiin verraten enemmän eri aikoina, mutta suurinta osaa siitä ei eritetty bakteerin ulkopuolelle. Kanta, johon sigK oli lisätty plasmidissa, reagoi samankaltaisesti, mutta vaikutukset eivät olleet yhtä voimakkaita. Tämä tarkoittaa, ettei geenin komplementaatio onnistunut täydellisesti. Saatuja tuloksia voidaan hyödyntää tulevissa tutkimuksissa C. botulinum -bakteeriin liittyen. The goal of this thesis study was to examine the effects of sigma factor K deletion on the sporulation process and toxin production of Beluga, a Clostridium botulinum group II type E strain. The many strains of C. botulinum differ from each other, and their genetic mechanisms are not very well known. The anaerobic bacterium produces both botulinum neurotoxin, which is the most potent toxin known to man, and spores that can survive and grow in food even after heat treatment. Botulism caused by the neurotoxin is a life-threatening and incurable disease. That is why knowledge of the species is important to prevent contraction of the disease. This project was carried out for the University of Helsinki’s Faculty of Veterinary Medicine’s Department of Food Hygiene and Environmental Health, in their C. botulinum -laboratory. During this project, a C. botulinum group II type E Beluga strain, where the sigK gene had been removed, was studied in a laboratory for three periods of ten days, using different methods. The strain was compared to the wild type and a strain where the sigK had been removed from the chromosome and then added in a plasmid. Sampling and measurements were performed every 24 hours until 120 hours and the last measurements were done 240 hours from inoculation. The laboratory work was executed using three different methods during the first weeks. The samples were photographed using a fluorescence microscope, their optical densities were evaluated by taking OD-measurements and the amounts of viable cells and heat resistant spores were investigated using MPN method. After that, ELISA tests were done to determine the samples’ toxin concentrations and the microscopy pictures were examined to count the bacteria in different stages of sporulation. Based on the results, it appears the absence of sigK in the Beluga strain affects negatively on the last stages of sporulation. The bacteria did not release most of their spores and they remained trapped inside of the cells instead. The maturation of the spores also seemed to have been incomplete. The population diminished noticeably over time, most likely due to the lack of viable spores. More toxin was found at different times compared to the wild type, but most of it was not secreted from the cells. The strain that was complemented with sigK in a plasmid reacted similarly, but the effects were not as drastic, indicating that total complementation was not achieved. The results gained from this study can be helpful in later studies regarding C. botulinum.