Expression und Charakterisierung der rezeptorbindenden Domäne des Influenza A H5N1 Virus
Ziel der Arbeit war die Charakterisierung und Expression der rezeptorbindenden Domäne der Influenza A H5N1 Virus sowie der Einsatz als kompetitiver Hemmstoff in der Influenzazellkultur. Die Charakterisierung erfolgte mit Hilfe von computerbasierten 3 D Rekonstruktionen des Virus. Anhand dieser wurde...
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Format: | Doctoral or Postdoctoral Thesis |
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Staats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky
2011
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ftsubhamburg:oai:ediss.sub.uni-hamburg.de:ediss/4452 2023-05-15T15:34:33+02:00 Expression und Charakterisierung der rezeptorbindenden Domäne des Influenza A H5N1 Virus Expression and characterization of the receptor binding site of Influenza A H5N1 Virus Häcker, Brit Fleischer, Bernhard (Prof. Dr.) 2011-01-01 http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:gbv:18-56392 https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/4452 ger ger Staats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:gbv:18-56392 https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/4452 http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 info:eu-repo/semantics/openAccess No license Avian flu Influenza A Virus 610 Medizin Gesundheit 44.43 Medizinische Mikrobiologie ddc:610 doctoralThesis doc-type:doctoralThesis 2011 ftsubhamburg 2022-11-09T07:10:47Z Ziel der Arbeit war die Charakterisierung und Expression der rezeptorbindenden Domäne der Influenza A H5N1 Virus sowie der Einsatz als kompetitiver Hemmstoff in der Influenzazellkultur. Die Charakterisierung erfolgte mit Hilfe von computerbasierten 3 D Rekonstruktionen des Virus. Anhand dieser wurde die Rezeptorstruktur des Hämagglutins HA 5 ermittelt und eine Strategie für das zu exprimierende Protein festgelegt. Nach Klonierung in einen bakteriellen Vektor erfolgte die Proteinexpression durch ein T-7 Promotor gesteuertes E.coli System. Nach Ermittlung der optimalen Expressionsbedingungen wurden verschiedene Vektoren verwendet sowie unterschiedliche Aufreinigungsverfahren für Proteine angewendet. Die Schwierigkeit lag dabei an der Bildung von intrazellulären Proteinaggregaten, wodurch sich dieses nicht auf nativem Wege aufreinigen ließ. Im Verlauf wurde eine Zelllyse mit Guanidinhydrochlorid mit anschließend renaturierender Proteinaufreinigung als vorteilhafteste Methode ermittelt. Das exprimierte Protein wurde quantifiziert und anhand von Western Blots als antigene Domäne des Hämagglutinins nachgewiesen. In einem zweiten Teil wurde ein Viruszellkultursystem für aviäre Influenzaviren aufgebaut. Ziel dessen war die Untersuchung des rekombinant hergestellten Hämagglutinins hinsichtlich einer kompetitiven Hemmung auf die Influenza-Virusreplikation. Zusätzlich wurde die Spezifität der Hemmung auf Influenza-A Subtypen untersucht. Eine MDCK-Zellkultur und die Standardisierung der Viruszellkultur für die beiden hochpathogenen Influenzaviren H5N1 und H7N7 wurden etabliert. Eine Quantifizierung mittels Plaque-Assay und Real-Time PCR gegen Influenza A Viren wurden angeschlossen. Eine kompetitive Hemmung des Viruswachstums von H5N1 durch Zugabe von rekombinant hergestelltem H5 konnte gezeigt werden. Dieser Effekt lies sich bereits durch eine Präinkubation mit H5 zeigen, welcher sich allerdings nach einem Tag aufhob. Beließ man rekombinantes H5 im Infektionsmedium, ließ sich das Viruswachstum bereits ab einer Konzentration ... Doctoral or Postdoctoral Thesis Avian flu ediss.sub.hamburg (Staats- und Universitätsbibliothek Hamburg, Carl von Ossietzky) |
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Ziel der Arbeit war die Charakterisierung und Expression der rezeptorbindenden Domäne der Influenza A H5N1 Virus sowie der Einsatz als kompetitiver Hemmstoff in der Influenzazellkultur. Die Charakterisierung erfolgte mit Hilfe von computerbasierten 3 D Rekonstruktionen des Virus. Anhand dieser wurde die Rezeptorstruktur des Hämagglutins HA 5 ermittelt und eine Strategie für das zu exprimierende Protein festgelegt. Nach Klonierung in einen bakteriellen Vektor erfolgte die Proteinexpression durch ein T-7 Promotor gesteuertes E.coli System. Nach Ermittlung der optimalen Expressionsbedingungen wurden verschiedene Vektoren verwendet sowie unterschiedliche Aufreinigungsverfahren für Proteine angewendet. Die Schwierigkeit lag dabei an der Bildung von intrazellulären Proteinaggregaten, wodurch sich dieses nicht auf nativem Wege aufreinigen ließ. Im Verlauf wurde eine Zelllyse mit Guanidinhydrochlorid mit anschließend renaturierender Proteinaufreinigung als vorteilhafteste Methode ermittelt. Das exprimierte Protein wurde quantifiziert und anhand von Western Blots als antigene Domäne des Hämagglutinins nachgewiesen. In einem zweiten Teil wurde ein Viruszellkultursystem für aviäre Influenzaviren aufgebaut. Ziel dessen war die Untersuchung des rekombinant hergestellten Hämagglutinins hinsichtlich einer kompetitiven Hemmung auf die Influenza-Virusreplikation. Zusätzlich wurde die Spezifität der Hemmung auf Influenza-A Subtypen untersucht. Eine MDCK-Zellkultur und die Standardisierung der Viruszellkultur für die beiden hochpathogenen Influenzaviren H5N1 und H7N7 wurden etabliert. Eine Quantifizierung mittels Plaque-Assay und Real-Time PCR gegen Influenza A Viren wurden angeschlossen. Eine kompetitive Hemmung des Viruswachstums von H5N1 durch Zugabe von rekombinant hergestelltem H5 konnte gezeigt werden. Dieser Effekt lies sich bereits durch eine Präinkubation mit H5 zeigen, welcher sich allerdings nach einem Tag aufhob. Beließ man rekombinantes H5 im Infektionsmedium, ließ sich das Viruswachstum bereits ab einer Konzentration ... |
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