Thermostabilization of VPR, a cold adapted subtilase, by proline substitutions into surface loops and monitoring the dynamics of the active site with electron paramagnetic resonance
Fyrri hluti verkefnisins snérist um að skilja hitastöðugleikaáhrif prólína í yfirborðslykkjum á kuldaaðlagaða serín próteasanum VPR úr Vibrio sp. (PA-44). Stökkbreytingarnar N3P, I5P, N238P og T265P sem voru framkvæmdar á VPR voru valdar samkvæmt prólínum sem eru til staðar í samstofna hitastöðuga p...
Main Author: | |
---|---|
Other Authors: | |
Format: | Thesis |
Language: | English |
Published: |
2018
|
Subjects: | |
Online Access: | http://hdl.handle.net/1946/30527 |
id |
ftskemman:oai:skemman.is:1946/30527 |
---|---|
record_format |
openpolar |
spelling |
ftskemman:oai:skemman.is:1946/30527 2023-05-15T18:13:29+02:00 Thermostabilization of VPR, a cold adapted subtilase, by proline substitutions into surface loops and monitoring the dynamics of the active site with electron paramagnetic resonance Arnór Freyr Sævarsson 1993- Háskóli Íslands 2018-05 application/pdf http://hdl.handle.net/1946/30527 en eng http://hdl.handle.net/1946/30527 Lífefnafræði Thesis Master's 2018 ftskemman 2022-12-11T06:57:25Z Fyrri hluti verkefnisins snérist um að skilja hitastöðugleikaáhrif prólína í yfirborðslykkjum á kuldaaðlagaða serín próteasanum VPR úr Vibrio sp. (PA-44). Stökkbreytingarnar N3P, I5P, N238P og T265P sem voru framkvæmdar á VPR voru valdar samkvæmt prólínum sem eru til staðar í samstofna hitastöðuga próteasanum aqualysin I (AQUI) úr Thermus aquaticus. Einföldu prólínafbrigðin N3P og I5P stöðguðu ensímið mest, þar á eftir kom T265P með minni stöðgun, en N238P sýndi minni hitastöðugleika miðað við villigerðina VPRΔC. Tvöföldu (N3P/I5P), þreföldu (N3P/I5P/N238P og N3P/I5P/T265P) og fjórföldu (N3P/I5P/N238P/T265P) prólínafbrigðin juku öll stöðugleika meira í samsettu prólínafbrigðunum en sem svaraði til stöðgunar vegna hverrar stakar prólín breytingar í einföldu stökkbrigðunum. Stöðgandi áhrifs hverrar prólín stökkbreytingar voru því samleggjanleg og í sumum tilvikum samverkandi í því að stögða ensímið. Afbrigðin sem sýndu mestu stöðgun voru N3P/I5P/T265P og N3P/I5P/N238P/T265P með í kringum 8-9°C aukningu í T50% og Tm. Öll afbrigðin höfðu svipaða virkni og villigerðin þannig að allar stökkbreytingarnar, fyrir utan N238P, juku stöðugleika án þess að hafa áhrif á virkni. Markmið seinni hluta verkefnisins var að athuga mögulegt samband milli virkni og hreyfanleika byggingar kuldavirka próteasans VPR og hitaþolna próteasans AQUI. Virku serín í hvarfstöðinni var breytt í cystein með efnafræðilegum aðferðum og svo spunamerkt. Hreyfanleiki spunamerkisins í hvarfstöð ensímanna var svo greindur með rafeindaspunagreiningu (EPR). Útlit EPR rófana og reiknaði hlutfallslegi hreyfanleikaþátturinn Ms benti til þess að hreyfanleiki spunamerkjanna í hvarfstöð VPRΔC og AQUI wt væri sá sami. Út frá þessu er svo gróflega hægt að áætla að hreyfanleikinn og nálægt umhverfi í kringum spunamerkta virka serínið, sem hefur verið breytt í cystein, sé svipað fyrir þessi tvö ensím. Þetta samræmist ekki þeirri hugmynd að kuldavirkni feli í sér aukinn sveigjanleika og hreyfanleika í hvarfstöð. Spunamerkið í hvarfstöð AQUI D98S, sem er með aukna ... Thesis sami Skemman (Iceland) |
institution |
Open Polar |
collection |
Skemman (Iceland) |
op_collection_id |
ftskemman |
language |
English |
topic |
Lífefnafræði |
spellingShingle |
Lífefnafræði Arnór Freyr Sævarsson 1993- Thermostabilization of VPR, a cold adapted subtilase, by proline substitutions into surface loops and monitoring the dynamics of the active site with electron paramagnetic resonance |
topic_facet |
Lífefnafræði |
description |
Fyrri hluti verkefnisins snérist um að skilja hitastöðugleikaáhrif prólína í yfirborðslykkjum á kuldaaðlagaða serín próteasanum VPR úr Vibrio sp. (PA-44). Stökkbreytingarnar N3P, I5P, N238P og T265P sem voru framkvæmdar á VPR voru valdar samkvæmt prólínum sem eru til staðar í samstofna hitastöðuga próteasanum aqualysin I (AQUI) úr Thermus aquaticus. Einföldu prólínafbrigðin N3P og I5P stöðguðu ensímið mest, þar á eftir kom T265P með minni stöðgun, en N238P sýndi minni hitastöðugleika miðað við villigerðina VPRΔC. Tvöföldu (N3P/I5P), þreföldu (N3P/I5P/N238P og N3P/I5P/T265P) og fjórföldu (N3P/I5P/N238P/T265P) prólínafbrigðin juku öll stöðugleika meira í samsettu prólínafbrigðunum en sem svaraði til stöðgunar vegna hverrar stakar prólín breytingar í einföldu stökkbrigðunum. Stöðgandi áhrifs hverrar prólín stökkbreytingar voru því samleggjanleg og í sumum tilvikum samverkandi í því að stögða ensímið. Afbrigðin sem sýndu mestu stöðgun voru N3P/I5P/T265P og N3P/I5P/N238P/T265P með í kringum 8-9°C aukningu í T50% og Tm. Öll afbrigðin höfðu svipaða virkni og villigerðin þannig að allar stökkbreytingarnar, fyrir utan N238P, juku stöðugleika án þess að hafa áhrif á virkni. Markmið seinni hluta verkefnisins var að athuga mögulegt samband milli virkni og hreyfanleika byggingar kuldavirka próteasans VPR og hitaþolna próteasans AQUI. Virku serín í hvarfstöðinni var breytt í cystein með efnafræðilegum aðferðum og svo spunamerkt. Hreyfanleiki spunamerkisins í hvarfstöð ensímanna var svo greindur með rafeindaspunagreiningu (EPR). Útlit EPR rófana og reiknaði hlutfallslegi hreyfanleikaþátturinn Ms benti til þess að hreyfanleiki spunamerkjanna í hvarfstöð VPRΔC og AQUI wt væri sá sami. Út frá þessu er svo gróflega hægt að áætla að hreyfanleikinn og nálægt umhverfi í kringum spunamerkta virka serínið, sem hefur verið breytt í cystein, sé svipað fyrir þessi tvö ensím. Þetta samræmist ekki þeirri hugmynd að kuldavirkni feli í sér aukinn sveigjanleika og hreyfanleika í hvarfstöð. Spunamerkið í hvarfstöð AQUI D98S, sem er með aukna ... |
author2 |
Háskóli Íslands |
format |
Thesis |
author |
Arnór Freyr Sævarsson 1993- |
author_facet |
Arnór Freyr Sævarsson 1993- |
author_sort |
Arnór Freyr Sævarsson 1993- |
title |
Thermostabilization of VPR, a cold adapted subtilase, by proline substitutions into surface loops and monitoring the dynamics of the active site with electron paramagnetic resonance |
title_short |
Thermostabilization of VPR, a cold adapted subtilase, by proline substitutions into surface loops and monitoring the dynamics of the active site with electron paramagnetic resonance |
title_full |
Thermostabilization of VPR, a cold adapted subtilase, by proline substitutions into surface loops and monitoring the dynamics of the active site with electron paramagnetic resonance |
title_fullStr |
Thermostabilization of VPR, a cold adapted subtilase, by proline substitutions into surface loops and monitoring the dynamics of the active site with electron paramagnetic resonance |
title_full_unstemmed |
Thermostabilization of VPR, a cold adapted subtilase, by proline substitutions into surface loops and monitoring the dynamics of the active site with electron paramagnetic resonance |
title_sort |
thermostabilization of vpr, a cold adapted subtilase, by proline substitutions into surface loops and monitoring the dynamics of the active site with electron paramagnetic resonance |
publishDate |
2018 |
url |
http://hdl.handle.net/1946/30527 |
genre |
sami |
genre_facet |
sami |
op_relation |
http://hdl.handle.net/1946/30527 |
_version_ |
1766186028342706176 |