Thermostabilization of VPR, a cold adapted subtilase, by proline substitutions into surface loops and monitoring the dynamics of the active site with electron paramagnetic resonance

• Main Author: Arnór Freyr Sævarsson 1993-
• Other Authors: Háskóli Íslands
• Format: Thesis
• Language: English
• Published: 2018
• Subjects: Lífefnafræði; sami
• Online Access: http://hdl.handle.net/1946/30527

Fyrri hluti verkefnisins snérist um að skilja hitastöðugleikaáhrif prólína í yfirborðslykkjum á kuldaaðlagaða serín próteasanum VPR úr Vibrio sp. (PA-44). Stökkbreytingarnar N3P, I5P, N238P og T265P sem voru framkvæmdar á VPR voru valdar samkvæmt prólínum sem eru til staðar í samstofna hitastöðuga próteasanum aqualysin I (AQUI) úr Thermus aquaticus. Einföldu prólínafbrigðin N3P og I5P stöðguðu ensímið mest, þar á eftir kom T265P með minni stöðgun, en N238P sýndi minni hitastöðugleika miðað við villigerðina VPRΔC. Tvöföldu (N3P/I5P), þreföldu (N3P/I5P/N238P og N3P/I5P/T265P) og fjórföldu (N3P/I5P/N238P/T265P) prólínafbrigðin juku öll stöðugleika meira í samsettu prólínafbrigðunum en sem svaraði til stöðgunar vegna hverrar stakar prólín breytingar í einföldu stökkbrigðunum. Stöðgandi áhrifs hverrar prólín stökkbreytingar voru því samleggjanleg og í sumum tilvikum samverkandi í því að stögða ensímið. Afbrigðin sem sýndu mestu stöðgun voru N3P/I5P/T265P og N3P/I5P/N238P/T265P með í kringum 8-9°C aukningu í T50% og Tm. Öll afbrigðin höfðu svipaða virkni og villigerðin þannig að allar stökkbreytingarnar, fyrir utan N238P, juku stöðugleika án þess að hafa áhrif á virkni. Markmið seinni hluta verkefnisins var að athuga mögulegt samband milli virkni og hreyfanleika byggingar kuldavirka próteasans VPR og hitaþolna próteasans AQUI. Virku serín í hvarfstöðinni var breytt í cystein með efnafræðilegum aðferðum og svo spunamerkt. Hreyfanleiki spunamerkisins í hvarfstöð ensímanna var svo greindur með rafeindaspunagreiningu (EPR). Útlit EPR rófana og reiknaði hlutfallslegi hreyfanleikaþátturinn Ms benti til þess að hreyfanleiki spunamerkjanna í hvarfstöð VPRΔC og AQUI wt væri sá sami. Út frá þessu er svo gróflega hægt að áætla að hreyfanleikinn og nálægt umhverfi í kringum spunamerkta virka serínið, sem hefur verið breytt í cystein, sé svipað fyrir þessi tvö ensím. Þetta samræmist ekki þeirri hugmynd að kuldavirkni feli í sér aukinn sveigjanleika og hreyfanleika í hvarfstöð. Spunamerkið í hvarfstöð AQUI D98S, sem er með aukna ...