Um método rápido e econômico para a obtenção de DNA de dentes para estudos forenses

• Main Author: Raimann, Paulo Eduardo
• Other Authors: Alho, Clarice
• Format: Master Thesis
• Language: Portuguese
• Published: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul 2006
• Subjects: BIOLOGIA; GENÉTICA LEGAL; ODONTOLOGIA LEGAL; CIÊNCIA FORENSE; Elevado; DML
• Online Access: http://hdl.handle.net/10923/1405

Introdução: Devido a sua estrutura mineralizada e inerte, ao seu tamanho e a sua localização, dentes molares e pré-molares são considerados boas fontes para obtenção do DNA necessário para a identificação molecular de pessoas. Várias metodologias têm sido empregadas para obtenção de DNA a partir dos dentes, sendo que o uso do equipamento de pulverização criogênica Freezer mill ® para a pulverização e da coluna concentradora MicroconTM-100 são procedimentos padrão mais utilizados e difundidos. O uso conjunto dessas duas metodologias é, porém, demorado e de custo elevado. Nós desenvolvemos este trabalho com o objetivo de testar e padronizar um novo método econômico e rápido para a obtenção de DNA de dentes para estudos forenses. O resultado deste trabalho vem a atender aos interesses do Convênio de Cooperação entre o Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular da PUCRS (PPGBCM-PUCRS) e o Instituto-Geral de Perícias (IGP-RS) da Secretaria da Justiça e da Segurança Pública do Rio Grande do Sul (SJS-RS), o qual visa desenvolver pesquisas que atendam às necessidades de avanço na linha de investigação da Biologia Forense. Material Foram utilizados dentes molares ou pré-molares provenientes de 26 cadáveres não identificados previamente, depositados no DML-RS. Para cada cadáver avaliado foi registrado seu estado geral de apresentação, o tempo estimado de morte, a idade e o local onde o cadáver foi encontrado. Os dentes foram retirados dos cadáveres, armazenados por no mínimo 24 horas a –80°C e, posteriormente, utilizados nos testes. A escolha dos corpos foi aleatória, abrangendo vários estágios de decomposição, tempo de morte e locais onde foram encontrados. Metodologia Material Foram utilizados dentes molares ou pré-molares provenientes de 26 cadáveres não identificados previamente, depositados no DML-RS. Para cada cadáver avaliado foi registrado seu estado geral de apresentação, o tempo estimado de morte, a idade e o local onde o cadáver foi encontrado. Os dentes foram retirados dos cadáveres, armazenados por no mínimo 24 horas a – 80°C e, posteriormente, utilizados nos testes. A escolha dos corpos foi aleatória, abrangendo vários estágios de decomposição, tempo de morte e locais onde foram encontrados. Metodologia Para a economia: (I) foi usado o moinho mineralógico IKA (Ika do Brasil – RJ- Brasil), de baixo custo em comparação ao uso do Freezer mill®; (II) foi usado precipitação do DNA com o uso de isopropanol, de baixo custo em comparação ao uso do MicroconTM-100. Para a rapidez: foi testado o tempo de duas horas para a incubação do tecido no tampão de lise celular em comparação ao tempo padronizado de 12 horas. Procedimentos: Nós usamos o moinho mineralógico IKA para obtenção de tecido pulverizado dos dentes a fim de extrair DNA na quantidade e qualidade necessárias para a obtenção de perfil genético. Cada amostra foi moída e separada em quatro subamostras, nas quais foi avaliado o tempo de incubação (2 ou 12 horas de incubação) e o método de precipitação final do DNA (MicroconTM–100 ou isopropanol). A quantidade e a qualidade do DNA obtido foram testadas. A viabilidade de uso do DNA nuclear e do DNA mitocondrial obtido foi verificada pela capacidade de amplificação por técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR) das amostras através do uso dos kits apropriados. Resultados e Discussão: A utilização do moinho mineralógico IKA para pulverização de tecido foi eficaz em todas as amostras testadas. As amostras processadas com MicroconTM-100 não apresentaram diferenças significativas na quantidade de DNA obtido quando incubadas por 2 ou 12 horas, o que permite aceitar que uma incubação de duas horas é suficiente para o procedimento padrão.O mesmo foi verificado nos subgrupos, nos quais, a precipitação foi realizada com isopropanol. Com o uso do MicroconTM-100 obteve-se uma concentração superior de DNA quando comparado ao uso do isopropanol (p<0,001). No entanto, a precipitação por isopropanol obteve um DNA de pureza superior ao do DNA processado com MicroconTM-100 (p<0,001). Dos 26 casos avaliados, dentes de 20 corpos tiveram seu DNA nuclear autossômico identificado com sucesso e, em dois dos 20 casos, foi também utilizada com sucesso a análise do cromossomo Y, não excluindo vínculo patrilíneo. Os seis demais casos apenas foram identificados pela análise do DNA mitocondrial, não excluindo o vínculo matrilíneo. A menor concentração de DNA derivada da precipitação realizada com isopropanol parece ter sido compensada pela maior pureza do material uma vez que houve similaridade do números de loci analisados com sucesso quando se comparam MicroconTM-100 e isopropanol. O estado geral do cadáver, o tempo estimado de morte, a idade e o local onde o cadáver foi encontrado não foram significativamente associados com a quantidade ou a qualidade do DNA obtido, bem como com o número de loci analisados com sucesso. Conclusão: A utilização do moinho mineralógico IKA para pulverização de tecido foi eficaz e pode substituir o uso do Freezer mill® reduzindo o custo dos procedimentos. A precipitação com isopropanol foi eficaz e pode substituir o uso do MicroconTM-100 reduzindo ainda mais o custo dos procedimentos. Um tempo de duas horas para a incubação do tecido no tampão de lise celular foi eficaz para reduzir o tempo dos procedimentos. Os experimentos desenvolvidos neste trabalho testaram e padronizaram um novo método rápido e econômico para a obtenção de DNA de dentes para estudos forenses, que pode ser empregado em outros caso de identificação de cadáveres humanos.O resultado deste trabalho poderá atender aos interesses do Convênio de Cooperação entre o PPGBCM-PUCRS e o IGP-RS no desenvolvimento e no avanço na linha de investigação da Biologia Forense.