以全細胞糖化與脂肪脢酯化系統生產麴酸及L-維他命C衍生物之研究 - 謝欣如; Hsin-Ju Hsieh (2007)
博士 國立清華大學 化學工程學系 本研究目的為運用酵素法合成麴酸與L-維他命C衍生物，改善其對光與熱的高度敏感性與減低對皮膚具刺激性的傷害，研究策略為利用脂解酵素酯化與全細胞糖化，來降低對皮膚的刺激傷害，以及增加衍生物對水溶性與酯溶性的溶解度、穩定度、產業應用性。 L-維他命C棕櫚酯生成條件：固定化酵素Candida antartica Lipase B (Novozym 435)為催化劑，L-維他命C與Palmitic acid反應基質比為1:4，50℃下以10 mL丙酮反應24小時，轉化率為47.6 ％，若添加3g/L的分子篩，其轉化率可提高到61.3 %。Novozym 435重複使用10次來生產L-維他命C棕櫚酯的平均轉化率為44.5 %，分離純化平均純度為99.8 %，平均回收率為89.1 %。固定化脂解酵素大幅提昇懸浮態酵素的酯化活性，L-維他命C棕櫚酯轉化率為46 ％。利用正己烷與低溫溶解度降低而析出L-維他命C棕櫚酯，其純化後純度為83 %，回收率為76 %。 L-維他命C糖苷生成條件：Aspergillus niger較佳的反應條件為1：9反應基質比，固定化細胞顆粒濃度4g/6 mL，0.02 M pH 5.5 Sodium acetate buffer，30℃下反應12小時，流速為12 ml/min，利用4 %褐藻膠固定化7g/L細胞為反應催化劑，固定化細胞顆粒重複使用13 次，其平均轉化率為72 %。α-Amylase、α-glucosidase、Glucoamylase及Glucosyltransferase在Pellet與Broth中根據培養天數來探討其酵素水解p-NGP之活性，Glucoamylase、α-glucosidase及Glucosyltransferase在Pellet與Broth中水解p-NGP之活性較α-Amylase顯著。Broth中的水解活性，隨著胞外酵素培養天數的增加而增加，Pellet中的水解活性，隨著胞外酵素培養天數的增加而減少。Aspergillus niger全細胞胞內與胞外糖化酵素之探討數據分析顯示，在Culture supernatant中，alpha-glucosidase在維他命C糖化反應中扮演最重要角色；在Pellet中，glucoamylase在維他命C糖化反應中是最主要的角色。分離純化L-維他命C醣苷，選用Amberlite? CG-400 anion exchange填充管柱，利用0.2 M NaCl溶液來脫附L-維他命C糖苷，合併使用Bio-Gel-P2填充管柱中，以二次水沖提出L-維他命C糖苷，其純度約為85 %，回收率約為75 %。 麴酸糖苷生成之條件：突變株Xanthomonas campestris以麥芽糖為碳源及NH4Cl為氮源，基質比1/8於0.01M HEPES緩衝液中，30℃反應28小時，轉化率82％。利用Sepharose G10管柱與活性碳管柱，以10％及70％酒精沖提出麴酸糖苷，純度為76％，回收率為71％。 黑色素細胞/纖維母細胞/角質細胞較佳的GAGs添加量分別為CS 0.8 mg/ml，DS 1.6 mg/ml，HA 0.1 mg/ml。Tyrosinase、tyrosinase-related protein 1、tyrosinase-related protein 2等基因中，添加2 mM Ascorbyl Glucoside的基因強度中，顯示Ascorbyl Glucoside對黑素色具有抑制的能力，而且tyr-1基因強度≧tyr-2基因強度，推測黑色素生成路徑是生成Eumelanin而不是Pheomelanin。Keratin 6、keratin 16、keratin 17等基因中，添加2 mM Ascorbyl Glucoside的基因強度中，顯示Ascorbyl Glucoside對角質素生成具有正向的影響效應。Procollagen基因中，添加2 mM Ascorbyl Glucoside的基因強度中，顯示Ascorbyl Glucoside對collageng生成具有正向的影響效應。 西方點墨法的實驗分析數據顯示在8mM的ascorbyl glucoside添加下，黑色素細胞/纖維母細胞/角質細胞在3D-scaffold內可生成較多的Collagen I。 3D-scaffold中，對照組中黑色素細胞/纖維母細胞/角質細胞生成的Collagen I隨著培養時間增加而增加。細胞染色角質素，由於角質素抗體無高度特異性，以致無法清楚分辨出纖維母細胞及角質細胞。 H&E細胞section染色圖顯示有投藥Ascorbyl glucoside的培養狀況下，細胞數生長的情況比不投藥Ascorbyl glucoside的好。 Alcian Blue細胞section染色顯示有投藥Ascorbyl glucoside的培養狀況下，新生細胞數的情況比不投藥Ascorbyl glucoside的好。 纖維母細胞投藥2mM培養，movie附加檔說明細胞遷移比未投藥的細胞遷移速度要快。說明ascorbyl glucoside有促進細胞遷移的效應，並且投藥的纖維母細胞定向性也大於未投藥的纖維母細胞，說明ascorbyl glucoside有促進細胞做直線遷移的效應。