Fasciola hepatica: diversidade genética e avaliação de SNPs associados a resistência ao albendazol em Portugal e Brasil

• Main Author: CHINJENGUE, Nataniel Paulino
• Other Authors: MAURÍCIO, Isabel, CALADO, Manuela
• Format: Master Thesis
• Language: Portuguese
• Published: Instituto de Higiene e Medicina Tropical 2016
• Subjects: Parasitologia médica; Fígado patologia; Genética; Portugal; Brasil; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas; Avalia; Elevado; Antarc*; Antarctica; Antártida
• Online Access: http://hdl.handle.net/10362/20070

Nos últimos anos, em muitos países, incluindo Portugal, a fasciolose tem vindo a ser considerada uma doença emergente, resultando num problema de saúde humana e animal, e com elevado impacte económico. O conhecimento da estrutura genética de populações de Fasciola hepatica é essencial quando se avalia o potencial de desenvolvimento e extensão da resistência aos anti-helmínticos, tais como fármacos triclorobendazol e albendazol. A espécie F. hepatica pode ser encontrada em todos os continentes, exceto a Antártida, enquanto que F. gigantica se encontra apenas na África e na Ásia. Ambas as espécies de Fasciola utilizam como hospedeiros intermediários moluscos de água doce da família Lymnaeidae. Utilizou-se uma amostra com um total de 94 vermes. Oitenta e sete vermes adultos de F. hepatica da coleção do Departamento de Helmintologia Médica do IHMT, fixados em etanol a 70% e armazenados a -20 ºC, obtidos entre 2009 e 2010 em matadouros de Portugal e provenientes de diversas regiões do país. Sete vermes tinham sido recolhidos no Brasil em 2015. Extraiu-se o DNA genómico através do protocolo de CTAB. Avaliaram-se três marcadores nucleares: ITS1, para identificação da espécie, o gene ribossomal 28S e o gene para TubB3, que é um marcador candidato de resistência aos fármacos. Avaliou-se também um marcador mitocondrial: citocromo c oxidase I. Os marcadores foram amplificados por PCR e sequenciados. No caso de 28S e de TubB3, SNPs de interesse foram genotipados com PCR específico desenvolvido no âmbito deste trabalho, e no qual se testou a eficiência de desemparelhamentos em bases na 2ª e na 3ª posições antes do extremo 3’. Redes filogenéticas foram geradas, para alinhamentos de sequências com bases ambíguas ou heterozigóticas, no programa SplitsTree4, utilizando o algoritmo NeighborNet e as distâncias calculadas através do modelo Kimura-2- parameter. A região ITS1 permitiu identificar as amostras como F. hepatica e mostrou ser bastante conservada. A região 28S mostrou heterozigotia na posição 115, que separa duas linhagens encontradas no leste Europeu, em todas as amostras Portuguesas e Brasileiras, sugerindo que esteja a ocorrer seleção de heterozigoto ou reprodução partenogénica. As regiões COI e TubB3 apresentaram diversidade intra-populacional em Portugal e no Brasil e em relação a outras regiões, assim como heterozigotia em várias posições, e poderão ser usadas em estudos populacionais alargados desta espécie nos dois países. Contudo, a alteração não sinónima na posição 311 de TubB3 não foi detetada nas amostras estudadas, sugerindo que este gene não está envolvido em resistência a fármacos em F. hepatica, pelo menos em Portugal ou no Brasil. O PCR específico para alelos mostrou ser uma alternativa à sequenciação para genotipagem de SNPs específicos num número grande de amostras, particularmente em estudos populacionais e na pesquisa de marcadores de resistência a fármacos. In recent years, in many countries, including Portugal, fascioliasis has been considered an emerging disease, being a human and animal health problem with high economic impact. Knowledge of the genetic structure of F. hepatica populations is essential when evaluating the potential for development and expansion of resistance to anthelmintics, such as triclorobendazole and albendazole. F. hepatica species can be found on every continent except Antarctica, while F. gigantica is only found in Africa and Asia. Both species of the genus Fasciola use, as intermediate hosts, fresh water molluscs of the Lymnaeidae family. Here, it was used a sample with a total of 94 adult flukes. Eighty-seven adult worms of F. hepatica from the collection of the Department of Medical Helminthology of the IHMT, fixed in 70% ethanol and stored at -20 ° C, obtained between 2009 and 2010 in Portugal slaughterhouses and from different regions of the country. Seven samples had been collected in Brazil in 2015. Genomic DNA was extracted by the CTAB protocol. Three nuclear markers were evaluated: ITS1 for species identification, the 28S ribosomal gene and the gene for TubB3, which is a candidate marker of drug resistance. It was also evaluated one mitochondrial marker: cytochrome oxidase I. The markers were amplified by PCR and sequenced. In the case of 28S and TubB3, SNPs of interest were genotyped with specific PCR developed in this work, and in which it was tested the efficiency of base mismatches in the 2nd and 3rd positions in relation to the 3 'end. Phylogenetic networks were generated from sequence alignments, which had ambiguous bases or were heterozygous, in the SplitsTree4 programme, using the NeighborNet algorithm and from Kimura-2-parameter model distances. ITS1 sequencing identified the samples as F. hepatica and was shown to be highly conserved. The 28S region showed heterozygosity at position 115, which separates two lineages found in Eastern Europe, in all Portuguese and Brazilian samples, suggesting there might be heterozygote selection or parthenogenic reproduction at play. The COI and TubB3 regions presented with intra-populational diversity in Portugal and Brazil in relation to other world regions and with heterozygosity at various positions. These markers can, thus, be used in wider population studies for this species in both countries. However, the non-synonymous change at TubB3 position 311 wasn’t detected in the samples analysed, suggesting that this marker is not involved in drug resistance in F. hepatica, at least in Portugal or Brazil. The allele specific PCR could be an alternative to full sequencing for genotyping SNPs in a large number of samples, particularly in population studies and research drug resistance markers.