OIE法定魚類病毒性疾病之監測及魚類免疫球蛋白之比較

• Main Authors: 盧彥蓓, Lu, Yan-Pei
• Other Authors: 簡茂盛, Maw-Sheng Chien, 中興大學, 宣詩玲, Shih-Ling Hsuan, 陳石柱, 蔡信雄, 徐榮彬, Shih-Chu Chen, Shinn-Shyong Tsai
• Format: Other/Unknown Material
• Language: English
• Published: 獸醫病理學研究所 2008
• Subjects: fish; 魚類; virus disease; immunoglobulin; 病毒性疾病; 免疫球蛋白; Salmo salar
• Online Access: http://hdl.handle.net/11455/15468

近年來國際間活魚及魚卵之貿易極為頻繁，因此實施嚴格之檢疫工作，方可避免國際間魚類重大傳染病之傳播。而依據OIE水生動物傳染性疾病列表中，高經濟價值的鮭鱒魚類疾病如Viral Hemorrhagic septicaemia (VHS)、Infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV)及Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV)等皆被各國列為主要監測的疾病。本研究目的旨在建立水生動物疾病監測系統並構築所檢測病原之陽性對照組，以達到精確快速之檢測依據。試驗首先為構築包含各檢測病原特異性基因片段之陽性質體，並應用試管內轉錄(in vitro transcription)之技術轉錄成RNA作為內部控制組(internal control)，再應用反轉錄聚合酵素連鎖反應(RT-PCR)同步來檢測檢體內之病毒核酸，以增加診斷作業之精確度。除測試反應最佳化之條件及敏感性外，並實際應用於進口鮭鱒魚、魚卵與國內養殖魚類之監測，以期達到快速精確之監測目的。而自95年7月至96年3月共篩檢台中地區160個進口樣品後，雖然尚未檢出IHNV及VHSV之陽性檢體，但於國內養殖之鱒魚及紅魽均可檢出IPNV陽性病例。此外，除了分子生物學診斷外尚可應用免疫血清學作為疾病監測，但由於水生動物的物種繁多，且跨種別間免疫球蛋白之差異性及對相同抗原之相互辨認度仍尚未明瞭，因此本研究亦針對不同魚種間之免疫球蛋白進行研究，嘗試評估不同魚種包括吳郭魚、淡水石斑、紅魽及虹鱒免疫球蛋白相互間之辨識能力，探討魚種間免疫球蛋白之差異性，以作為日後進一步研究魚類免疫機制之基礎。 Viral hemorrhagic septicaemia virus (VHSV), infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV), and infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) are major pathogens listed on OIE notifiable fish diseases among several species of salmonid fish. As the international trade of egg, juvenile, and aquatic animal products between countries become more frequent, it is important to establish more precise and strict inspections under OIE regulation to exclude these pathogens from Taiwan. The aim of this study was to establish several internal positive controls for monitoring sensitivity and specificity during RT-PCR diagnosis. Several plasmids containing the conserved sequence of partial viral genome were constructed and RNAs were synthesized in vitro as internal positive controls for epidemiological surveillance. During July 2006 to March 2007, 160 collected samples including salmons (Salmo salar), rainbow trouts (Oncorhynchus mykiss), sweet fishes (Plecoglossus altivelis), and greater amberjacks (Seriola dumerili) from markets in Taichung area were screened. The results showed IPNV could be detected in rainbow trout and greater amberjacks, but neither IHNV nor VHSV could be found in all tested samples at this moment. Except for molecular biological diagnosis, the immunoserological assay is another alternative method for monitoring infectious fish diseases. However, the variation of antibodies among different fish species may dramatically affect the cross-species recognition of immunoglobulin. Therefore, a rabbit-anti-tilapia immunoglobulin antibody was produced and used to compare the difference of recognition between families of teleost using Western blotting method. These results may provide valuable information for understanding the immune system in different teleost fish. 頁次 中文摘要 --- i 英文摘要 --- ii 目次 --- iii 圖次 --- vi 表次 --- viii 第一章 前言 --- 1 第二章 文獻探討 --- 3 第一節 病毒性出血性壞死病毒(VHSV)之基本特性 --- 3 一、VHSV之歷史背景及感染宿主種類 --- 3 二、VHSV之遺傳物質及蛋白質功能 --- 3 三、VHSV血清型及基因型分類 --- 4 四、VHSV感染途徑 --- 5 五、VHSV之臨床症狀及病理變化 --- 5 六、VHSV診斷方法 --- 6 第二節 傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)之基本特性 --- 7 一、IHNV之歷史背景及感染宿主種類 --- 7 二、IHNV之遺傳物質及蛋白質功能 --- 7 三、IHNV血清型及基因型分類 --- 8 四、IHNV感染途徑 --- 9 五、IHNV之臨床症狀及病理變化 --- 9 六、IHNV診斷方法 --- 9 第三節 傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)之基本特性 --- 10 一、IPNV之歷史背景 --- 10 二、IPNV生化特性及其結構 --- 10 三、IPNV之遺傳物質與蛋白質功能 --- 11 四、IPNV血清型及基因型分類 --- 12 五、IPNV感染途徑及感染宿主種類 --- 13 六、IPNV之臨床症狀及病理變化 --- 14 七、IPNV之診斷方法 --- 14 第四節 多種病毒複合感染之情形 --- 16 第五節 魚類免疫球蛋白 --- 16 一、免疫球蛋白之結構 --- 17 二、魚類與哺乳類免疫球蛋白之比較 --- 17 三、免疫球蛋白之基因及同型轉換 --- 22 四、各魚種之間免疫球蛋白之差異性 --- 23 第三章 材料與方法 --- 25 第一節 魚類樣本之採集及處理 --- 25 第二節 IHNV及VHSV試管內轉錄RNA之RT-PCR敏感度測試 --- 26 第三節 IPNV陽性轉殖載體之構築 --- 27 一、IPNV部分VP2基因序列之合成 --- 27 二、重組轉殖載體之篩選及序列確認 --- 30 三、IPNV VP2片段A及B轉殖載體構築(pIPNV-A+B) --- 31 第四節 試管內轉錄部分IPNV之RNA --- 33 一、RNA試管內轉錄作用(in vitro transcription) --- 33 二、試管內轉錄RNA稀釋濃度及特異性引子敏感度測試 --- 34 第五節 檢測系統之建立 --- 34 一、樣本新鮮度檢測 --- 34 二、IHNV及VHSV之檢測 --- 35 三、IPNV之檢測 --- 35 四、IPNV陽性樣本之基因型及血清型分類 --- 35 第六節 兔抗吳郭魚免疫球蛋白抗體 --- 36 一、吳郭魚免疫球蛋白純化 --- 36 二、抗吳郭魚免疫球蛋白多價血清之製備 --- 38 三、兔抗吳郭魚免疫球蛋白多價抗體辨認其他動物種別之情形 --- 39 四、兔抗吳郭魚免疫球蛋白多價抗體辨認其他物種之情形 --- 39 第四章 結果 --- 42 第一節 魚類樣本之採集及病理檢查結果 --- 42 第二節 IHNV及VHSV試管內轉錄RNA之RT-PCR敏感度測試 --- 42 第三節 IPNV陽性轉殖載體之構築 --- 42 第四節 試管內轉錄部分IPNV之 RNA --- 44 第五節 檢測系統之建立 --- 44 第六節 兔抗吳郭魚免疫球蛋白抗體製備 --- 45 第五章 討論 --- 48 參考文獻 --- 75