Біотехнології штучного магнітомічення та природне магнітомічення клітин тварин

• Main Author: Булаєвська, Марина Олександрівна
• Other Authors: Горобець, Світлана Василівна
• Format: Thesis
• Language: Ukrainian
• Published: Київ 2021
• Subjects: біогенні магнітні наночастинки; біотехнологія штучного магнітомічення; магнетит; магнітна сепарація; феримагнітні органели; атомносилова мікроскопія; магнітно-силова мікроскопія; електронний парамагнітний резонанс; наноструктурна локалізація; біоінформатичний аналіз; biogenic magnetic nanoparticles; biotechnology of artificial magnetic labeling; magnetism; magnetite; magnetic separation; ferrimagnetic organelles; atomic force microscopy; magnetic force microscopy; electron paramagnetic resonance; nanostructured localization; bioinformatics analysis; Salmo salar; Щука
• Online Access: https://ela.kpi.ua/handle/123456789/44703

Робота виконана на кафедрі біоінформатики КПІ ім. Ігоря Сікорського. На сьогодні біогенні магнітні наночастинки (БМН) виявлено у представників усіх трьох надцарств живих організмів: Прокаріоти, Археї та Еукаріоти. У більшості філогенетичних груп тварин, які належать до багатоклітинних еукаріотичних організмів, визначено біомінералізовані БМН, зокрема у комах, амфібій та рептилій, птахів, а також ссавців. Біогенні магнітні наночастинки знайдено також у нормальних тканинах мозку, печінки, серця, селезінки, надниркових залоз та решітчастої кістки людини. Наявність БМН вивчали, в основному, з точки зору орієнтації організмів в зовнішньому магнітному полі Землі. Ідея про магнітотаксис була дуже прогресивною і сприяла тому, що в багатьох наукових центрах світу розпочалися інтенсивні дослідження цього явища в різних мікроорганізмах. Зокрема дослідження самого процесу створення таких природних магнітів, у тому числі на генетичному рівні. Після того ж, як БМН було виявлено в багатоклітинних організмах, ідею про магнітотаксис, як основну їх функцію, було трансформовано в ідею про важливу роль БМН у магніторецепції (відчутті організмами магнітних полів, у тому числі магнітного поля Землі). Ідею магніторецепції глибоко вивчали і продовжують вивчати, але однозначного експериментального підтвердження знайдено не було – навіть під час дослідження орієнтації перелітних птахів у геомагнітному полі, не кажучи вже про людину. На цей час залишається відкритим питання, які ще біологічні функції, крім навігації та магніторецепції, можуть мати БМН як у магнітотаксисних бактерій, так і у інших організмів. Вже понад 30 років увагу дослідників привертає фізіологічне походження БМН в органах та тканинах тварин. Ця проблема є дуже важливою, оскільки, наприклад, підвищений рівень БМН пов’язаний із низкою захворювань людини. Дослідження механізмів синтезу БМН у різних організмах має важливе фундаментальне значення для визначення ролі БМН в патогенезі захворювань людини, які супроводжуються підвищенням їх вмісту. В свою чергу, магнітомічені клітини використовують у дослідженнях цілеспрямованої доставки лікарських препаратів та як біосорбенти. На даний час є докладні дослідження біомінералізації БМН мікроорганізмами, але що стосується багатоклітинних організмів, то наявні лише фрагментарні дослідження біомінералізації біогенних магнітних наночастинок. Магнітні наночастинки знаходять все ширше біомедичне застосування: від контрастних агентів для магнітної резонансної томографії (МРТ) до досліджень знищення ракових клітин за допомогою лікування гіпертермією. Більшість з цих перспективних програм вимагає чітко визначених і керованих взаємодій між магнітними наночастинками і живими клітинами. В зв’язку з цим актуальною задачею є дослідження наноструктурної локалізації БМН, їх морфології та кількості в різних органах та тканинах тварин, а також дослідження накопичення штучних магнітних наночастинок. Мета роботи – теоретичне обґрунтування та експериментальне дослідження біотехнології штучного магнітомічення та природного магнітомічення клітин тварин. Для досягнення мети роботи були поставлені такі завдання. 1. Виявити можливих продуцентів БМН серед немігруючих риб, використовуючи методи порівняльної геноміки. 2. Встановити наявність БМН в органах та тканинах миші Mus musculus, свині Sus domestica, коропа Cyprinus carpio та даніо реріо Danio rerio. 3. Визначити основні закономірності просторово-морфологічних властивостей БМН у різних тканинах і органах тварин та встановити відповідність з рослинами й грибами. 4. Провести дослідження накопичення магнітних наночастинок в органах даніо реріо Danio rerio в процесі штучного магнітомічення. 5. Розробити технологію виділення клітин з природними та штучними пара-, фери-, або феромагнітними властивостями. 6. Розрахувати сили взаємодії між біогенними магнітними наночастинками та штучними магнітними наночастинками. Об’єкт дослідження – біотехнології штучного магнітомічення та природне магнітомічення клітин у тварин, геноми та протеоми тварин в базі даних GenBank, органи та тканини тварин, біомаса магнітомічених клітин органів тварин. Предмет дослідження – закономірності природного та штучного магнітомічення клітин тварин. Методи дослідження: біоінформатичні (методи порівняльної геноміки), фізико-хімічні (світлова мікроскопія, електронний парамагнітний резонанс, скануюча зондова мікроскопія, методи виготовлення магнітних наноміток, рНметрія, термометрія), біологічні (цитологічні методи, гістологічні методи), математичні (математична статистика, математичне моделювання). Наукова новизна отриманих результатів. Вперше за допомогою біоінформатичних методів показано, що немігруючі риби можуть бути продуцентами біогенних магнітних наночастинок. Вперше методами електронного парамагнітного резонансу та магнітно-силової мікроскопії продемонстровано наявність біогенних магнітних наночастинок в органах та тканинах як мігруючих, так і немігруючих риб. Вперше показано, що БМН в органах та тканинах тварин локалізовані в провідних тканинах, так само, як у рослин та грибів. Вперше продемонстровано накопичення магнітних наночастинок в мозку, серці, печінці й нирках риб Danio rerio за умови штучного магнітомічення, та лише часткове їх виведення. Практичне значення отриманих результатів. Показане у роботі накопичення штучних магнітних наночастинок у різних органах тварин важливо враховувати у разі діагностики за допомогою МРТ з використанням контрастних речовин та у разі цілеспрямованої доставки лікарських препаратів за допомогою векторів, що містять магнітні наночастинки. Показано можливість застосування системи двох постійних магнітів зі щілиною для детекції та виділення клітин з природними та штучними пара-, фери-, або феромагнітними властивостями. Результати роботи впроваджено у навчальний процес у КПІ ім. Ігоря Сікорського, а саме: у викладання дисципліни «Основи біоінформатики» для студентів спеціальності 133 – Галузеве машинобудування та дисципліни «Науково-практичні основи біоінформатики» для студентів спеціальності 162 – Біотехнології та біоінженерія на кафедрі біоінформатики. За допомогою біоінформатичних методів в роботі показано, що серед немігруючих риб продуцентами БМН можуть бути короп звичайний (Cyprinus carpio) та щука звичайна (Esox lucius). Досліджено органи та тканини лосося атлантичного Salmo salar та товстолобика звичайного Hypophthalmichthys molitrix на предмет наявності БМН. В результаті аналізу спектрів магнітного резонансу показано, що ширина спектру сигналу решітчастої кістки товстолобика звичайного та решітчастої кістки лосося атлантичного є однаковою. Ширина сигналу магнітного резонансу характеризує типи взаємодій, які існують між феримагнітними частинками та їх оточенням. Отже, однакова ширина піків спектрів магнітного резонансу свідчить про те, що у складі решітчастої кістки товстолобика звичайного та решітчастої кістки лосося атлантичного наявні БМН. Максимальний розмір БМН у решітчастих кістках досліджуваних риб має однаковий порядок величини. Так само і кількість магнітних наночастинок у ланцюжках. В середньому ланцюжки БМН, які були детектовані за допомогою магнітно-силової мікроскопії, в решітчастих кістках риб, містять по 6±1 магнітних наночастинок. Визначено основні закономірності просторово-морфологічних властивостей БМН у різних тканинах та органах миші Mus musculus, свині Sus domestica, коропа Cyprinus carpio та показано, що: - БМН в досліджуваних органах багатоклітинних організмів утворюють ланцюжки; - БМН в багатоклітинних організмах входять до складу їх провідної системи. Так, БМН у тварин розміщені в стінках капілярів (всі досліджені органи і тканини, окрім решітчастої кістки) або в околі капілярів (решітчаста кістка). БМН у рослин розміщені в стінці провідної тканини, а саме в стінці ситовидних трубок флоеми. БМН в грибах розташовані в стінці провідної тканини, а саме в стінках судиноподібних гіфів. Така локалізація БМН свідчить на користь ідеї, що ланцюжки БМН можуть бути задіяні в трофічних процесах. Досліджено процес штучного магнітомічення клітин тварин та встановлено поступове збільшення кількості структурних елементів, які дають позитивну реакцію Перлса, на 1 добу, 7 добу, 14 добу та 28 добу експерименту в мозку, серці, печінці та нирках, що свідчить про накопичення екзогенних магнітних наночастинок переважно в тих органах, в яких показано наявність біогенних магнітних наночастинок. Через 28 діб після завершення введення штучних магнітних наночастинок Danio rerio, на 56 добу експерименту, кількість структурних елементів в досліджуваних органах, які дають позитивну реакцію Перлса було дещо меншою, ніж на 7, 14 та 28 добу експерименту, проте вищою у порівнянні з контролем. Аналогічні результати отримано під час визначення магнітофоретичної рухливості. На 1 добу, 7 добу, 14 добу, 28 добу спостерігалося зростання магнітофоретичної рухливості кластерів клітин усіх досліджуваних органів Danio rerio. На 56 добу експерименту, через 28 діб після завершення перорального введення магнітних наночастинок, спостерігалося незначне зменшення магнітофоретичної рухливості кластерів клітин мозку, серця, печінки та нирок, яке однак не досягало контрольного рівня. Отже, відбувалося лише часткове виведення штучно введених ззовні магнітних наночастинок з досліджуваних органів. Отримані дані слід враховувати у разі використання екзогенних магнітних наночастинок з діагностичною та лікувальною метою. Запропоновано спосіб виділення клітин з природними та штучними магнітними властивостями, який дає змогу зменшити витрати часу на виявлення та виділення клітин з природними та штучними пара-, фери-, або феромагнітними властивостями за рахунок використання системи магнітів зі щілиною, яка має більш просту конструкцію порівняно з аналогами. Такий спосіб дає змогу працювати як з сухою біомасою клітин, так і з суспензією, що є важливим для застосувань в біонанотехнологіях. Розраховано сили магнітодипольної взаємодії, що виникають між біогенними магнітними наночастинками органів риб та екзогенними магнітними наночастинками, які знаходяться в діапазоні від 10-11 Н до 10-10 Н. Завдяки магнітодипольній взаємодії відбувається накопичення введених магнітних наночастинок в мозку, серці, печінці та нирках риб, що може зумовлювати зміни метаболічних процесів в них. Особистий внесок здобувача. Результати наукової роботи, які викладено в дисертації, одержані автором особисто або за його безпосередньої участі. Планування експериментальної роботи проведено спільно із науковим керівником. Дослідження біологічних зразків із застосуванням магніторезонансної спектроскопії проводили спільно з д. ф.-м. н., с. н. с. В. О. Голубом. Дослідження біологічних зразків із застосуванням атомносилової мікроскопії та магнітно-силової мікроскопії проводили спільно з к. т. н. І. В. Шарай. Розрахунки сили магніто-дипольної взаємодії між біогенними магнітними наночастинками та штучно введеними магнітними наночастинками здійснювали спільно з д. ф.-м. н., проф. О. Ю. Горобець. Особисто автором описано результати досліджень, проведено їх аналіз та обговорення. Спільно із науковим керівником сформульовано висновки. За темою дисертаційної роботи опубліковано 29 наукових праць: 1 стаття у періодичному науковому виданні держави, яка входить до Організації економічного співробітництва та розвитку та Європейського Союзу, 3 статті у виданнях, які цитуються у науково-метричній базі SCOPUS; 2 статті у наукових виданнях, включених до переліку наукових фахових видань України, 23 тез доповідей.