Zastosowanie immobilizowanych lipaz jako narzędzi do poszukiwania ich inhibitorów - Pociecha, Dagmara
Celem pracy było opracowanie parametrów metody służącej do przesiewowych, wstępnych badań dla syntetyzowanych w Katedrze Chemii Organicznej CMUJ związków będących potencjalnymi inihibitorami lipaz. Realizując założenia pracy wykorzystano lipazy Pseudomonas cepacia oraz Candida antarctica B, obie kowalecyjnie związane z położem Immobead 150 oraz komercyjnie dostępne inhibitory lipaz: orlistat i hesperydynę. Jako chromgeniczny substrat w prowadzonych reakcjach enzymatycznych posłużył zsyntetywowany w Katedrze Chemii Organicznej CMUJ dodecylan p-nitrofenolu. We wszystkich prowadzonych reakcjach enzymatycznych ilość uwalnianego pNP była monitorowana przy użyciu spektrofotometru UV-VIS. W reakcjach z udziałem orlistatu jako inhibitora lipazy Pseudomonas cepacia pomiary były przeprowadzane także przy użyciu HPLC z detektorem UV. Zmiany aktywności enzymatycznej były wyznaczane na podstawie reakcji prowadzonej z 5mg naważką lipazy oraz ze stężeniami substratu 1,6mM/L oraz 0,8mM/L odpowiednio dla lipaz Pseudomonas cepacia i Candida antarctica B. Użycie substratu o niższym stężeniu dla Candida antarctica B wynikało z większej aktywności tego enzymu. W przeprowadzonych badaniach najsilniejszą inhibicję wynoszącą 74,44% wykazał orlistat względem lipazy Pseudomonas cepacia. W pozostałych przypadkach wyniki pomiarów nie były jednoznaczne. Wynosiły one 18,32% dla hesperydyny vs. Pseudomonas cepacia, oraz 14,65% dla hesperydyny vs. Candida antarctica B, natomiast wynik otrzymany dla orlistatu vs. Candida antarctica B, był wyższy niż w przypadku analogicznej reakcji przeprowadzonej bez udziału inhibitora, co wskazywałoby na aktywację lipazy. W przypadku wykazanej najsilniejszej inhibicji (orlistat vs. Pseudomonas cepacia) wyznaczono wartość parametru IC50, która wynosi 108,38µg/ml co odpowiada stężeniu 0,22mM/L. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, że immobilizowane lipazy mogą posłużyć jedynie we wstępnych badaniach przesiewowaych dla potencjalnych inhibitorów lipaz. Posługując się opracowaną metodą można wyłonić z grupy badanych związków najsilniejsze inhibitory, które charakteryzować się będą inhibicją podobną do inhibicji orlistatu. W przypadku inhibitorów wykazujących niewielką inhibicję wyniki nie są zbyt wiarygodne, z powodu zbyt dużej wartości względnego odchylenia standardowego (RSD) pomiarów absorbancji służących do wyznaczania inhibicji. The purpose of the thesis was the determination of parameters of the screening test method for compounds being potential lipase inhibitors (synthesized in the Department of Organic Chemistry) using the immobilised lipases. Realising this objective, the Pseudomonas cepacia and Candida antarctica B lipases, both covalently bound with Immobead 150 and commercially available inhibitors of lipases: orlistat and hesperidine were used. Synthesized in the Department of Organic Chemistry dodecilate paranitrophenolate was used as chromogenic substrate. In all performed enzymatic reactions the measurements of released pNP were monitored using the spectrophotometer UV-VIS. In the reactions applying orlistat as inhibitor of Pseudomonas cepacia lipase the results were additionally examined using HPLC with UV detector. The applied weighted portions of lipases (5 mg) and substrate concentrations 1,6mM/L for the Pseudomonas cepacia lipase and 0,8mM/L for Candida antarctica B lipase (characterised by higher enzymatic activity) were determined on the basis of the initial study.In the conducted measurements the largest inhibition, ranging 74,44%, displayed orlistat versus Pseudomonas cepacia lipase. In the case of other measurements, conducted in similar conditions, the results were not very clear and definite. They ranged 18,32% for hesperidine versus Pseudomonas cepacia lipase and 14.65% for hesperidine versus Candida Antarctica B lipase, whereas the result of the reaction orlistat versus Candida antarctica B lipase suggested the activation of this lipase. For the largest inhibition (orlistat versus Pseudomonas cepacia lipase) the determined IC50 parameter yielded 108,38µg/ml (=0,22mM/L). The results of performed analysis indicate that immobilized lipases can be used in the screening tests for the examining of new compounds as inhibitors of lipases. These tests will allow to distinguish strong inhibitors of the effectiveness similar to orlistat. In the case of compounds exhibiting low inhibition the results are not very reliable due to very high relative standard deviation (RSD) of the absorbation measurements.