| Summary: | Tese de doutoramento em biologia (Microbiologia) apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2010 Lyme borreliosis, is a tick-borne disease caused by Borrelia burgdorferi sensu lato, that is considered an emerging disease in some regions of the world, namely in Portugal. The B. burgdorferi s. l. complex includes 16 different species that are transmitted to the vertebrate host by the tick vector. The principal vector in Europe is Ixodes ricinus. LB is a multisystem disease involving many organs such as the skin, the nervous system, the joints, and the heart. The main goal of this project is to examine specific biological and molecular aspects of B. lusitaniae. The aims of this dissertation are divided into two main topics: Human infection and the eco-epidemiological study of B. burgdorferi s.l. in Portugal. Although LB is a mandatorily notifiable disease in Portugal, the evaluation of CEVDI/INSA data concerning human cases and the number of notified cases shows that this disease is clearly underreported in Portugal. In the period of 1999-2004, the estimated incidence was 0.4 per 100 000 inhabitants, which is relatively low when compared with some endemic countries. In this work it was reported an isolation of B. lusitaniae from a human patient presenting with a vasculitis-like syndrome that confirm the patogenicity of this genospecies. This clinical report supports also the hypothesis that the clinical manifestations associated with infection by B. lusitaniae include some clinical symptoms until this moment considered unspecific for LB. In a prospective study, twelve patients with clinical diagnostic of LB were analysed and enabled the first detection of B. afzelii DNA in a patient with neurological symptoms. A survey of ixodid ticks collected in Madeira Island and southern region revealed that both are hotspot regions for the presence of B. lusitaniae, however other Borrelia genospecies were detected in Madeira Island. Moreover, Ixodes ricinus species was confirmed as the principal vector of this zoonosis in Portugal. Other species such as Dermacentor marginatus were found to contain Borrelia DNA, but the ability of this tick to transmit B. burgdorferi is unknown. The sequences analysis of the isolates obtained from ticks from the southern region reveal that some recombinants strains are present which could indicate that an intersection in the allelic profiles of the B. lusitaniae populations exists. In this dissertation is also described the first report of dual infections of Rickettsia helvetica, R. monacensis and R. slovaca, each of which infected with B. lusitaniae, highlighting the increased likelihood of infection by multiple agents to humans. Concerning the study on migratory shorebirds the detection of B. garinii DNA was observed in three different genera (black-tailed godwits Limosa l. limosa, Icelandic black-tailed godwit Limosa l. islandica and little stints Calidris minuta) and also Francisella tularensis subsp. holarctica DNA in a little stint. The studies conducted in animal species prove the involvement of the small mammals, Apodemus sylvaticus, as a potential reservoir of B. lusitaniae with the first isolate from this animal species. Seropositive samples were obtained from M. spretus and R. rattus species. Phylogenetic analyses grouped this new isolate near other B. lusitaniae strains isolated within this dissertation and most closely aligned to the North African clade. Furthermore the importance of lizards (Teira dugessi) in the maintenance of B. burgdorferi s.l. was confirmed. Potential B. valaisiana isolation from lizard tissues and detection on parasitizing ticks was reported for the first time, but this observation needs conformation. B. lusitaniae DNA was also detected in lizard tissues and in ticks that are collected from them. However, the sequence data from lizards’ isolation suggest the co-existence of B. lusitaniae. This data indicates that there may exist a sylvatic cycle specific to the B. lusitaniae, maintained by a variety of hosts and reservoirs. Many aspects introduced and explored in this work will require more detailed investigations. However, this dissertation contributes to clarify some important epidemiological aspects of the clinical and laboratorial diagnosis of LB, a disease with impact in public health in Portugal. A borreliose de Lyme, também conhecida como doença de Lyme, é uma doença emergente em algumas regiões do mundo, nomeadamente em Portugal. Caracteriza-se por ser ume patologia multifásica e multissistémica, com manifestações dermatológicas, reumatológicas e cardíacas. O agente etiológico responsável por esta patologia é a bactéria do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.) que, até ao momento, inclui 16 espécies diferentes. O principal vector é ixodídeo do complexo Ixodes ricinus. O principal objectivo desta dissertação é estudar os aspectos biológicos e moleculares de B. lusitaniae, focando-se essencialmente em dois aspectos, a infecção nos Humanos e o estudo da eco-epidemiologia de B. burgdorferi s.l. em Portugal. Para corresponder aos objectivos acima citados, inicialmente foi realizado um estudo para avaliar o impacto desta doença em Saúde Pública. Como resultado foi possível constatar que, apesar de ser uma doença de notificação obrigatória, a análise dos dados obtidos pelo laboratório de referência CEVDI/INSA entre 1990-2004, relativamente aos casos diagnosticados versus os casos notificados revela que, tal como outras doenças transmitidas por ixodídeos, se trata claramente de uma doença sub-notificada em Portugal. A incidência estimada anual é de 0.4 por 100 000 habitantes, relativamente baixa quando comparada com alguns países europeus. Outro objectivo deste trabalho foi avaliar a potencial acção patogénica de B. lusitaniae. Neste sentido, foi feito um grande esforço para a obtenção de amostras biológicas, posteriormente utilizadas nas tentativas de isolamento. Como resultado, neste trabalho é descrito o segundo caso de isolamento de B. lusitaniae a partir de uma amostra de sangue total de uma doente que apresentava uma vasculite-like, o que confirma que esta genoespécie é patogénica ao Homem. Este caso clínico suporta a hipótese de que as manifestações clínicas associadas à infecção por B. lusitaniae incluem alguns sinais clínicos considerados, até ao momento, inespecíficos no diagnóstico de borreliose de Lyme. De forma a contribuir para o esclarecimento do quadro clínico da borreliose de Lyme em Portugal, dada a elevada prevalência de B. lusitaniae nos ixodídeos, foi realizado um estudo retrospectivo,onde foram analisados 12 doentes com diagnóstico clínico confirmado. Este trabalho permitiu a detecção, pela primeira vez, de DNA de B. afzelii num doente com sintomas neurológicos. Na vertente eco-epidemiológica, foi dada particular importância à identificação das espécies de vectores e hospedeiros vertebrados responsáveis pela circulação destes agentes na natureza. No que se refere aos artrópodes vectores, o estudo realizado nos ixodídeos na Ilha da Madeira e na região sul de Portugal revelou que ambas são regiões importantes para a presença de B. lusitaniae. No entanto, outras genospécies de Borrelia foram detectadas na Ilha da Madeira. Além disso, a espécie I. ricinus foi confirmada como principal vector na transmissão desta zoonose em Portugal. No entanto, outras espécies de ixodídeos, como Dermacentor marginatus, mostraram poder estar também implicadas na transmissão de borreliose de Lyme, uma vez que foi detectado DNA de Borrelia em alguns exemplares. Contudo, a capacidade e competência para transmitir B. burgdorferi s.l. continua desconhecida. A análise das sequências nucleotidicas obtidas a partir dos isolados dos ixodídeos da região sul de Portugal sugerem a presença de algumas espécies recombinantes, o que confirma a presença de variabilidade genética intra-especifica de B. lusitaniae nestas populações Alguns estudos publicados anteriormente demonstraram que por vezes a presença de alguns agentes etiológicos condicionam o ciclo natural de outros agentes. Assim, foi também objecto de estudo investigar a existência de co-infecções nos artrópodes vectores. Nesta dissertação é também descrita pela primeira vez a presença de co-infecções nos ixodídeos de B. lusitaniae com Rickettsia helvetica, R. monacensis ou R. slovaca, sublinhando o possível aumento de infecção em humanos por múltiplos agentes infecciosos. Relativamente ao estudo dos hospedeiros reservatórios, inicialmente foi investigado o papel desempenhado pelas aves limícolas migratórias. Como principais resultados salienta-se que foi possível detectar a presença de DNA de B. garinii em três diferentes géneros (Limosa l. limosa, Limosa l. islandica e Calidris minuta) e de Francisella tularensis subsp. holarctica em um C. minuta, realçando a possibilidade de disseminação de novos agentes infecciosos por estas espécies de aves. Outros estudos direccionados nos animais, provaram o envolvimento dos pequenos mamíferos como potenciais reservatórios de B. lusitaniae, uma vez que foi possível isolar pela primeira vez esta genoespécie a partir de uma amostra de Apodemus sylvaticus. A análise filogenética agrupou este novo isolado perto de outras estirpes de B. lusitaniae isoladas durante o decurso desta dissertação e muito próximas do “cluster” de Norte de África. Foram também obtidas amostras sero-positivas das espécies M. spretus e R. rattus. Este resultado é extremamente importante em termos ecológicos, pois permite conhecer melhor os mecanismos que permitem a manutenção de B. lusitaniae na natureza. A importância das lagartixas, especialmente as pertencentes à espécie Teira dugessi na manutenção da infecção de B. burgdorferi s.l., foi confirmada. O isolamento de B. valaisiana a partir de tecidos de lagartixa e a detecção de DNA a partir de ixodideos colectados destes animais, foi descrito pela primeira vez. No entanto, a análise das sequências nucleotidicas dos isolados obtidos sugerem a co-existência de B. lusitaniae. Este trabalho permitiu ainda detectar DNA de B. lusitaniae nos tecidos e nos ixodídeos das lagartixas, confirmando a possibilidade destes animais servirem como reservatórios desta genoespécie. Os dados obtidos, relativamente a estes estudos, indicam que existe um ciclo silvático específico para B. lusitaniae que é mantido por uma variedade de hospedeiros e reservatórios vertebrados. Muitos aspectos focados neste trabalho necessitam de uma investigação mais detalhada. No entanto, esta dissertação contribuiu para clarificar importantes aspectos epidemiológicos de borreliose de Lyme, essenciais para se estabelecerem medidas de controlo e prevenção, para além de contribuir para o estabelecimento de um diagnóstico clínico e laboratorial mais preciso da doença com impacto na Saúde Pública em Portugal. Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge; Fundação para a Ciência e Tecnologia, (FCT),(SFRH/BD/38369/2007); Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa; Centers for Diseases and Control, Fort Collins; Fundação Luso Americana info:eu-repo/semantics/publishedVersion
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