Βιοπαρακολούθηση λιμένων Ελλάδας και Ισπανίας με γενετικές και μεταγονιδιωματικές μεθόδους

• Main Author: Τσαρτσιανίδου, Βαλεντίνα Παναγιώτη
• Format: Text
• Language: Greek
• Published: Aristotle University of Thessaloniki 2016
• Subjects: βιοπαρακολούθηση; θαλάσσιο περιβάλλον; γενετικές μέθοδοι; biomonitoring; marine environment; genetic methods; Crassostrea gigas
• Online Access: https://dx.doi.org/10.26262/heal.auth.ir.285321; https://ikee.lib.auth.gr/record/285321

Η διερεύνηση της βιοποικιλότητας των θαλάσσιων οικοσυστημάτων προσελκύει όλο και περισσότερο το επιστημονικό ενδιαφέρον. Ανάμεσα στα θαλάσσια οικοσυστήματα εκείνα που επιδέχονται έντονη ανθρωπογενή δραστηριότητα, όπως είναι οι λιμένες και οι κόλποι, υφίστανται διαταραχές που έχουν επίπτωση στη διατήρηση της συνολικής ισορροπίας τους και συνεπώς αξίζουν ιδιαίτερης διερεύνησης. Τέτοιου τύπου περιβάλλοντα είναι περισσότερο «επιρρεπή» στην εισαγωγή μη ενδημικών ειδών τα οποία εξαπλώνονται, καθιερώνονται και απειλούν την ενδημική βιοποικιλότητα. Η χρήση γενετικών μεθόδων για την ταυτοποίηση και τον εντοπισμό ειδών τα τελευταία χρόνια σε συνδυασμό με τις παραδοσιακές μεθόδους συνεισφέρουν σημαντικά στην αποτίμηση αυτής της βιοποικιλότητας. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε α) συλλογή 100 δειγμάτων από τις αποβάθρες των λιμένων της Θεσσαλονίκης και της Ηγουμενίτσας με σκοπό την ταυτοποίηση είδους με τη χρήση της μεθοδολογίας DNA barcoding, καθώς και β) συλλογή ατόμων από λιμένες της Ισπανίας για το σχεδιασμό 16S rRNA ειδοειδικών ζευγών εκκινητών που στοχεύουν στα είδη-εισβολείς Crassostrea gigas, Ruditapes philippinarum, Mya arenaria, Xenostrobus securis. Ο στόχος αυτών των μοριακών εργαλείων αφορά τον εντοπισμό των εισαχθέντων ειδών σε περιβαλλοντικά δείγματα από λιμένες της βορειο-δυτικής Ισπανίας. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε συλλογή περιβαλλοντικού δείγματος από τον λιμένα της Θεσσαλονίκης με στόχο της εκτίμηση της συνολικής βιοποικιλότητας μέσω της eDNA metabarcoding προσέγγισης. Όσον αφορά το πρώτο σκέλος των αποτελεσμάτων, 25 είδη ταυτοποιήθηκαν από τις προβλήτες των ελληνικών λιμένων. Οι αλληλουχίες που συλλέχθηκαν συνθέτουν μία αρχική γενετική βάση δεδομένων, η οποία αποσκοπεί στην αποθήκευση γενετικών δεδομένων χρήσιμων για τον σχεδιασμό ειδοειδικών ζευγών εκκινητών, καθώς και στην σύγκριση των DNA barcoding και metabarcoding προσεγγίσεων στην ταυτοποίηση της βιοποικιλότητας του θαλάσσιου περιβάλλοντος. Σχετικά με τα είδη-εισβολείς, διάφορα ειδοειδικά ζεύγη εκκινητών σχεδιάστηκαν και αξιολογήθηκαν σε in silico, in vitro και in vivo έλεγχο, μερικά εκ των οποίων εντόπισαν επιτυχώς τα είδη-στόχους στις περιβαλλοντικές συνθήκες που προσομοιάστηκαν στον εργαστηριακό χώρο. Το μιτοχονδριακό γονίδιο 16S rRNA δεν αποτελεί πάντοτε κατάλληλο μοριακό δείκτη για τέτοιες προσεγγίσεις, όπως αποδείχθηκε. Στο τρίτο σκέλος των αποτελεσμάτων, που αφορά τη συνολική εκτίμηση της βιοποικιλότητας στον λιμένα της Θεσσαλονίκης, αντιμετωπίστηκαν διάφορα προβλήματα. Η αδυναμία της N.G.S. προσέγγισης να καταγράψει την ευκαρυωτική ποικιλότητα του λιμένα σχετίζεται με την μεγάλης διάρκειας παραμονή του φίλτρου σε αιθανόλη πριν την απομόνωση του DNA και με την μετέπειτα κακή ποιότητα γενετικού υλικού που απομονώθηκε από το δείγμα. Για το λόγο αυτό, πραγματοποιήθηκαν δύο βιοπληροφορικές αναλύσεις με σκοπό την εξαγωγή όσο το δυνατόν πιο αντιπροσωπευτικών αποτελεσμάτων με βάση τις αλληλουχίες που υπήρχαν διαθέσιμες. Στα αποτελέσματα της βιοπληροφορικής ανάλυσης ταυτοποιήθηκε τελικά κυρίως η βακτηριακή σύνθεση του λιμένα (με χαρακτηριστικό παράδειγμα το γένος Pseudomonas) καθώς και οτ ευκαρυωτικό είδος-εισβολέας Xenostrobus securis, το οποίο για πρώτη φορά καταγράφεται στο λιμάνι αυτό. Το συμπέρασμα που προκύπτει από τα τρία επιμέρους σκέλη των γενετικών τεχνικών που χρησιμοποιήθηκαν, αφορά την στρατηγική δειγματοληψίας που ακολουθείται η οποία πρέπει να συνάδει με πολύ καλή γνώση της οικολογίας του εκάστοτε θαλάσσιου περιβάλλοντος που μελετάται καθώς και με τεχνικές λεπτομέρειες που αφορούν τον στόχο που τίθεται κάθε φορά. Η συγκεκριμένη διπλωματική εργασία αποτελεί μία πρώτη προσέγγιση της δυνατότητας βιοπαρακολούθησης λιμένων μέσω γενετικών και μεταγονιδιωματικών μεθόδων στα επίπεδα της ταυτοποίησης και εντοπισμού συγκεκριμένων ειδών αλλά και εκτίμησης της συνολικής βιοποικιλότητας. Οι DNA τεχνικές συνεχώς αναπτύσσονται και θα συμβάλλουν τα μέγιστα σε αυτή την κατεύθυνση. : Biodiversity research of marine ecosystems consists an expanding scientific field. Marine ecosystems such as ports and gulfs, which are susceptible to anthropogenic activities, are of special interest. These types of environments are prone to the introduction of non endemic species which can spread, establish and consequently threaten the endemic biodiversity. During the last years, genetic methods have proven very effective for species detection as well as for biodiversity assessment from environmental samples in combination with classic methods. This study concerns a) the collection of 100 individuals from Thessaloniki and Igoumenitsa ports in order to identify these species using DNA barcoding, as well as b) the collection of individuals from Spanish ports with the purpose of designing 16S rRNA species specific primers for the following invasive species: Crassostrea gigas, Ruditapes philippinarum, Mya arenaria, Xenostrobus securis. The aim of these molecular tools is the detection of invasive species from environmental samples which are collected from Spanish ports. Furthermore, water collection from Thessaloniki port was carried out, in order to estimate the overall biodiversity through DNA metabarcoding. Concerning the first section of results, 25 species were identified in total from the Greek ports. Sequences collected compose an initial genetic database for these ports. Such genetic data constitute potential “material” for designing species specific genetic tools or comparing different genetic approaches in purpose to estimate marine biodiversity. Concerning the second part of results, which attributes to invasive species, several pairs of species specific primers were designed and assessed in silico, in vitro and in vivo and selected pairs were useful for species detection in simulated communities. Mitochondrial gene 16S rRNA is not always appropriate for such approaches. Concerning biodiversity estimation for Thessaloniki bay, which represents the third experimental part, bioinformatic results identified many bacterial species, a small part of eukaryotic composition of the bay and the presence of the invasive species Xenostrobus securis, which was discovered in this port for the first time. As a general conclusion, inability of NGS approach to estimate the eukaryotic biodiversity of the port is related to the storing of filters in ethanol for a long time before DNA extraction. Furthermore, the low DNA quantity and quality extracted from the environmental sample influence final results. Taking into account these factors, two bioinformatic analyses were performed in order to extract as much information as possible. A main conclusion of this work, concerns the importance of proper design of sampling strategy. Further research is needed to improve sampling strategies regarding both ecological and special characteristics of ports as well as for the specific species of interest. Summarising, this study constitutes an approach for a port biomonitoring process using DNA barcoding and metabarcoding methods, in order to identify and detect specific species present into the water but also for biodicersity assessment. DNA methods are expected to contribute greatly in this direction.