镁离子对长牡蛎闭壳肌松弛作用初探及离子通道蛋白的提取研究

• Main Author: 刘凤华
• Other Authors: 毕允晨
• Format: Other/Unknown Material
• Language: Chinese
• Published: 2022
• Subjects: 镁离子; 长牡蛎; 闭壳肌松弛; 电压门控钙离子通道; 蛋白纯化; 生物学; 理学; Pacific; Crassostrea gigas; Pacific oyster
• Online Access: http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/178303

镁离子是一种广泛使用的海洋软体动物肌肉松弛剂，获取方便、性质稳定、毒副作用小。在高剂量 镁离子 作用下，牡蛎发生闭壳肌松弛并丧失对外界刺激的反应，这一过程至少涉及平滑肌和横纹肌两种类型的肌肉松弛，与脊椎动物中高剂量 镁离子 仅能使平滑肌松弛的表现十分不同。 该差异体现了有代表性的、值得关注的神经肌肉作用方式，因此深入讨论其背后的分子机制十分必要，目前有关该机制的研究仍属空白。 本文以 长牡蛎（ Crassostrea gigas ）为研究对象，围绕镁离子使长牡蛎闭壳肌发生松弛这一生理现象背后的机制分别在个体水平和分子水平展开初步探究，主要研究内容与结果如下： 1 ）对镁离子使长牡蛎闭壳肌发生松弛的生理现象进行验证，对比分析部分其他一价、二价、三价金属离子是否会对长牡蛎闭壳肌产生相似的松弛作用。实验结果表明，与其他金属离子相比，镁离子使长牡蛎闭壳肌松弛的作用十分有效， 30 g/L 是较优的镁离子处理浓度，浸泡处理 45 min 即可使 80% 的长牡蛎发生闭壳肌松弛；降低镁离子浓度至 15 g/L 或 7.5 g/L 时，处理时间足够长的前提下也可使全部长牡蛎发生闭壳肌松弛。本研究实验中采用的 Mg 2+ 浓度均未对长牡蛎的生存造成不利影响。在其他金属离子，如一价离子 Li + 、 Na + 、 K + ，二价离子 Co 2+ 、 Mn 2+ 、 Sr 2+ ，三价离子 Fe 3+ 中，只有 MnCl 2 和 SrCl 2 体系对长牡蛎表现出微弱的闭壳肌松弛作用。 2 ） 探究了镁离子造成长牡蛎闭壳肌松弛过程中钙离子的拮抗作用。设计不同浓度镁离子 / 钙离子共存的溶液体系，以及镁离子 / 钙离子 /EGTA 溶液体系，观察并统计长牡蛎的生理状态变化。结果显示，随着镁钙共存体系中钙离子浓度的升高，发生闭壳肌松弛的长牡蛎个体随之减少，当镁钙摩尔比为 2:5 时， 90% 的长牡蛎样本无法产生闭壳肌松弛，并且 MgCl 2 溶液处理后发生闭壳肌松弛的长牡蛎可在该体系中恢复至正常生理状态，用 EGTA 螯合全部钙离子后，长牡蛎再次发生闭壳肌松弛。以上数据说明镁离子对长牡蛎的闭壳肌松弛作用会受到高剂量钙离子的抑制。 3 ） 钙离子通道在肌肉运动过程中发挥了重要作用。依据前述生理实验结果，并结合脊椎动物中镁离子可在电压门控钙离子通道（ VGCC ）上拮抗钙离子的相关研究，本论文在分子水平的实验主要定位在长牡蛎闭壳肌 VGCC 复合体上。基于 β 亚基与 α1 亚基之间较强的亲和力，将原核表达纯化的重组 β 亚基用于 VGCC 复合体的 pull down 纯化。完成了长牡蛎闭壳肌中 VGCC β 亚基的克隆，构建了 GST-β 、 β-His 、 His-β 等多种不同表达载体，对 β 亚基进行原核表达及纯化条件优化，结果表明 GST-β 亚基的纯度和产量更高；将纯化的 GST-β 亚基用于 VGCC 复合体的 pull down 纯化，未获得足量的高纯度 VGCC 复合体。同时，经过序列分析，发现 β 亚基具有多组组氨酸残基聚集的区域，制备并纯化了无标签的野生型 β 亚基重组蛋白。相比于 GST-β 亚基， 借助 无标签亲和层析纯化得到的野生型 β 亚基重组蛋白为单体且纯度更高。无标签亲和层析纯化的方法可用于长牡蛎 VGCC 复合体的提取纯化及各步骤的监测。 4 ） 通过突变实验，探究了无标签亲和层析纯化方法的序列基础。发现重组蛋白对 Ni-NTA 的结合能力与剩余较连续组氨酸残基的数量呈正相关。免疫印迹对组氨酸残基的数量及连续性的要求更高， (HG) 7 序列是组氨酸标签特异性抗体识别的关键序列。 本论文主要关注镁离子使长牡蛎闭壳肌发生松弛这一生理现象，提出了其背后机制是镁离子在 VGCC 上对钙离子的拮抗，并开展了 VGCC 关键亚基的表达纯化和 VGCC 复合体的初步提取研究，研究结果为后续长牡蛎 VGCC 复合体的结构解析提供了必不可少的研究基础，为阐释以长牡蛎为代表的软体动物的神经肌肉活动调控机制提供了参考。同时，无标签亲和层析纯化方法为具有相似特点的蛋白纯化提供了借鉴，也为解决缺乏特异性抗体的蛋白复合体的分离纯化监测难题贡献了新思路。