长牡蛎(Crassostrea gigas) TLR和RLR信号通路的免疫功能研究

• Main Author: 杜以帅
• Other Authors: 张国范
• Format: Other/Unknown Material
• Language: Chinese
• Published: 2013
• Subjects: 长牡蛎; 牡蛎疱疹病毒; 天然免疫研究; Crassostrea gigas
• Online Access: http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/17725

牡蛎是我国乃至世界重要的海水养殖品种，自1972年在美洲牡蛎中发现了疱疹样病毒，到目前为止，全世界范围内多种双壳贝类中已经检测到牡蛎疱疹病毒-1（Oyster Herpesvirus-1, OsHV-1），并且OsHV-1已被证明与幼虫的大规模死亡有关，在繁育季节幼虫的大规模死亡也为养殖业带来了巨大的经济损失。目前国内外关于牡蛎对OsHV-1的免疫机制的研究还处于一片空白之中，并且对OsHV-1引起的贝类的死亡和病害没有十分有效的解决办法，严重影响了牡蛎养殖业的健康和可持续发展。因此研究牡蛎对OsHV-1的天然免疫反应，从牡蛎机体本身研究其对OsHV-1的免疫防御机制，为预防OsHV-1引起的死亡和病害提供理论基础，也为减少养殖业的的损失提供有力帮助。 本研究以长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象，利用细胞生物学，生物信息学、分子生物学和免疫学等手段，对长牡蛎幼虫和幼贝对OsHV-1的天然免疫反应进行了系统研究，获得的结果如下： TLRs与RLRs是天然免疫防御中重要的模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRR），通过RACE技术从长牡蛎中克隆得到了其所属的TLR和RLR信号通路中的关键基因cDNA全长，其中TLR信号通路包括4个TLR基因（分别命名为Cg05421 TLR、Cg17269 TLR、Cg21740 TLR和Cg27513 TLR）和2个接头分子MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene 88)基因（分别命名为CgMyD88-1和CgMyD88-2），RLR信号通路包括11个RIG-I (Retinoic acid-inducible gene-I)基因（命名为RIG-I-1到RIG-I-11）和一个接头分子MAVS基因（命名为CgMAVS），除此之外还得到了TRAF基因（TNF receptor associated factor）（命名为CgTRAF2和CgTRAF6）和IRF基因（Interferon regutory facror）（命名为Cg07268 IRF、Cg07269 IRF和Cg16646 IRF）完整的ORF序列。通过SMART结构域分析，发现这些基因大部分具有与脊椎动物同源基因相似的结构域特征，并且氨基酸序列具有一定的相似性，并通过构建进化树分析了这些基因在不同物中的进化地位。 通过对长牡蛎生长发育表达谱数据进行cluster分析，挑选表达稳定的cluster中并且与人类管家基因同源的9个基因与长牡蛎中常用的内参基因18S rRNA (18S), 28 rRNA (28S), elongation factor-1 (EF-1α), β-actin (ACT) 和 glyceraldehyde-3 phosphate-dehydrogenase (GAPDH)共同作为候选内参基因，通过qRT-PCR（Quantitative real time PCR）技术和GeNORM软件分析在被OsHV-1感染的幼虫样品和未被OsHV-1感染的幼虫样品中进行内参基因的筛选，结果表明核糖体蛋白基因RL7与RS18是最适合作为长牡蛎D型幼虫时期和壳顶幼虫时期qRT-PCR的内参基因。在获得最佳内参基因基础上，对4个TLR基因和9个RIG-I基因在OsHV-1攻毒前后的长牡蛎幼虫样品中，通过qRT-PCR的方法研究其mRNA的相对表达量变化，结果表明：3个TLR基因在OsHV-1攻毒后壳顶期U2出现峰值，一个TLR基因和9个RIG-I基因都在壳顶期U5出现峰值。针对这些结果提出一个假说：三个TLR基因（Cg05421 TLR、Cg17269 TLR和Cg21740 TLR）参与牡蛎幼虫对OsHV-1的识别或者介导OsHV-1进入牡蛎细胞的细胞膜过程，其蛋白质应该定位在细胞膜上；Cg27513 TLR基因和RIG-I基因参与识别OsHV-1进入牡蛎细胞后自身复制产生的中间产物（DNA或者RNA），其蛋白质定位应该在细胞质内。采用EGFP融合蛋白的方法做了4个TLR基因的亚细胞定位实验对这个假说进行验证，结果表明4个TLR基因均定位于细胞质与内涵体中，虽然与假说不符，但是长牡蛎中TLR基因定位于内涵体中发挥作用是国际上的首次报道。另外两个MyD88基因CgMyD88-1与CgMyD88-2均定位于细胞质内与其生物学功能相称。 为了进一步验证TLR与RLR通路关键基因对OsHV-1的免疫防御作用，将含有OsHV-1的上清液攻毒长牡蛎幼贝。TLR通路中TLR基因与MyD88基因均可被OsHV-1诱导上调并且在一些时间点与对照形成显著性差异(p < 0.05)，并且通过酵母双杂交实验发现Cg27513 ...